人心肌特异表达基因p93、Nelin的原核表达与纯化

发布时间：2020-04-09 19:14

【摘要】：目的p93和Nelin是近年来在构建成人心脏cDNA文库并进行新ESTs(expressed sequence tags)分离的基础上，克隆出的心脏特异表达的基因。为研究其功能，进行基因的原核蛋白表达与纯化。采用分子克隆技术，分别构建p93与Nelin的全长及缺失体片段的原核表达载体，并进行表达纯化，以获取p93与Nelin的重组蛋白。 方法(1)携带p93全长的GST融合表达载体pGEX-5X-p93转化大肠杆菌BL21，IPTG诱导，产物分别用谷胱甘肽琼脂糖层析柱和电泳切胶分离纯化。(2)设计带有Nco Ⅰ／Xho Ⅰ酶切位点的引物，，以已构建好的质粒pGEX-5X-p93为模板，用PCR分别扩增出p93全长及p93的激酶与丝氨酸结构域的C端1 200bp的片段(后者简称为p93-C)，并用Nco Ⅰ／Xho Ⅰ酶切PCR产物和原核表达载体pET28a(+)，用T4 DNA连接酶分别将其连接，得到重组表达质粒载体pET28a-p93和pET28a-p93-C。质粒经双酶切鉴定和测序验证。重组表达质粒pET28a-p93和pETF28a-p93-C转化大肠杆菌BL21(DE3)，用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导，SDS-PAGE进行分析，产物用Ni~(2+)金属螯合吸附层析柱纯化。(3)采用Western杂交的方法用抗GST多克隆抗体验证GST-p93蛋白，用抗GST-p93多克隆抗体验证p93-his_6和p93-C-his_6蛋白。(4)Nelin基因的蛋白质预测分析。用Kyte-Doolittle方案预测蛋白质的亲水性，Emini方案预测蛋白质的表面可及性，Welling方案预测蛋白质的抗原性，Karplus-Schulz标准分析肽链柔性，经综合分析以预测Nelin基因的B细胞表位。(5)根据B细胞表位，结合同源比，以Nelin基因所包含的F-actin结合结构域和Ig结构域为划分区段标志，设计3个Nelin基因的缺失体片段：Nelin-1,1-133aa;Nelin-2,66-252 aa;Nelin-3,227-448aa。其中Nelin-2含有F-actin结合结构域，Nelin-3含有Ig结构域。(6)利用基因重组技术构建GST融合的原核表达载体pGEX-5X／Nelin1～3，和C端带有his_6纯化标签的载体pET28a-Nelin-Ⅰ。转化大肠杆菌BL21(DE_3)，IPTG诱导，SDS-PAGE分析，Western杂交验证。 结果(1)GST-p93蛋白获得了高效表达，并主要以包涵体形式存在，谷胱甘 廷边大毋 硕士研究生学位论文 肤琼脂糖层析柱纯化后杂蛋白较多，电泳切胶分离纯化得到了纯度在95%以上的 GsT-p93蛋白。(2)成功构建了pET28a-p93和pET28a一p93一C原核表达载体。 P93一c一his。与p93一his6融合蛋白亦均以包涵体形式存在。用镍离子困iz+)金属鳌合 吸附层析柱纯化得到了纯度在95%以上的p93一his6和p93一C一his6蛋白。经Bradford 法测定，100ml菌液诱导后可得到o.smg纯化的p93一his6蛋白或Zmg纯化的 p93一C一his6蛋白。(3)Western杂交检测后确认pGEX一SX一p93、pET28a一p93和 pET28a一P93一C的表达产物均为正确产物。(4) Nelin基因氨基酸序列N端的27~ 39区段、90一102区段、158一170区段可能为B细胞优势表位区域。(5)Nelin一l 在pGEX和pET两套表达系统中均有较高水平表达，nelin一2表达较低，nelin一3 表达水平极低。选择带有his6标签的nehn一!作为纯化对象，经Ni2+金属鳌合层 析纯化，得到了nelin一1一his6蛋白，纯度在95%以上。 结论重组GST-p93与Nelin一卜his6蛋白的成功纯化使P93与Nelin的多抗和 单抗制备得以完成，p93的激酶与丝氨酸结构域的C端片段在大肠杆菌中的表达 与纯化，为其复性研究以及进一步的结构和功能研究提供了条件。
【学位授予单位】：延边大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：Q78

【参考文献】

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本文编号：2621156