成年大鼠脑神经干细胞的分离培养与BMP4胆碱能诱导分化

发布时间：2020-04-13 20:26

【摘要】：研究已证实神经干细胞具有自我更新的能力及多向分化的潜能。不同细胞因子可影响神经干细胞的增殖和分化过程。神经干细胞分化的神经元可以表达多种神经递质，如GABA、P物质、多巴胺等，然而在未加特殊诱导的情况下，绝大多数神经干细胞自然分化成GABA能神经元，自发分化为其他表型的神经元非常罕见。许多研究表明通过调节细胞因子可以改变神经干细胞的分化方向，将神经干细胞诱导分化为某一特定类型的细胞。有人报道骨形态发生蛋白9(BMP9)可以通过诱导乙酰胆碱转移酶和乙酰胆碱转运囊基因的表达，而上调培养神经细胞的乙酰胆碱的合成；脑室内注射BMP9可增加活体动物脑组织内的乙酰胆碱水平，认为BMP9是中枢神经系统的胆碱能分化因子。BMP家族中的BMP4是否具有对神经干细胞的胆碱能诱导分化及上调神经细胞的胆碱能表达作用，尚未见实验报道。本实验通过离体细胞培养及在体动物实验了解BMP4是否具有上述作用。首先，从2月龄SD大鼠海马、纹状体、第三脑室和侧脑室的硕士学位论文成年大鼠脑神经干细胞的分离培养与BMP4胆碱能诱导分化 VZ、SVZ区中分离出神经干细胞。采用机械分散和化学消化法分离出的细胞，用无血清培养液培养;以Nestin、NF160和GFAP抗体作为一抗，进行免疫细胞化学染色。结果显示，在光学相差显微镜下见培养的细胞具有神经干细胞的形态特点和增殖特性;免疫细胞化学染色见培养的细胞呈Nestin反应阳性，NF 1 60、GFAP反应阴性，即细胞具备神经干细胞的免疫学特性。然后，将神经干细胞的培养液中加入或不加入BMP4，，观察其胆碱能分化状况。将培养的神经干细胞分成两组，BMP4组改用加入 BMP4的诱导培养液培养，无BMP4组仍用原来的培养液培养作为对照;培养8天后，对培养细胞分别行ChAI…抗体间接免疫荧光染色、 ChAT抗体和Nestin抗体SABC一DS双标免疫细胞化学染色及FITC标记的胆碱能流式细胞检测。结果显示BMP4组较多细胞发出较强的绿色荧光，呈ChAT阳性;而无BMP4组较少的细胞发出较弱的ChAT 荧光。免疫双标细胞化学染色可见到三类细胞:一类为ChAT抗体反应阳性细胞，其细胞浆呈紫蓝色，其中部分细胞呈典型的神经元形态特征;第二类为Nestin抗体反应阳性细胞，其细胞浆呈红色，细胞呈圆形或前体样细胞的形态，部分细胞处于分裂过程中;第三类为Nestin 和ChAI，抗体反应阴性细胞，其细胞浆中未着色，细胞具有神经元形态特征。显微镜下计数，BMP4组的细胞中，ChAT反应阳性的约占 28%，Nestin反应阳性的约占38%;而无BMP4组的细胞中，Ch户a，反应阳性的约为8%，Nestin反应阳性的约为52%。流式细胞术检测 BMP4组的ChAT阳性细胞率显著高于二无BMP4组(16%、7%， P0 .05)。结果表明:BMP4对原代分离、体外培养的大鼠脑海马及纹状体等区的神经干细胞具有胆碱能分化诱导作用。第三，将BMP4注入成年大鼠右侧海马齿状回观察其对神经细胞硕士学位论文成年大鼠脑神经干细胞的分离培养与BMP4胆碱能诱导分化胆碱能表达的影响。将20只成年雄性SD大鼠随机分成两组:BMP4 组和盐水对照组。麻醉后，采用立体定位技术将1风BMP4(BMP4 组)或生理盐水(对照组)注入大鼠右侧海马齿状回区。14天后取脑，石蜡包埋切片，行ChAT抗体免疫组化染色。用图像分析系统计算大鼠左右两侧海马齿状回的ChAT阳性细胞总面积，用51，Al’A 7.0软件进行t检验。结果显示ChAT阳性神经元在海马CAI、CAZ、CA3及齿状回均有分布;BMP4组大鼠右侧海马齿状回区Ch户门尸阳性细胞面积显著高于左侧(P0.01);而对照组大鼠左右两侧海马齿状回内 ChAT阳性细胞面积无显著差异(P0.05)。两组比较，BMP4组大鼠右侧海马齿状回内ChAI…阳性细胞面积显著高于对照组的相同部位 (P0.01);而两组间左侧海马齿状回内ChAI，阳性细胞面积无显著差异(P.05)。结果提示，海马齿状回区接受BMP4注射后，可诱导该区的细胞出现较高的胆碱能表达。总之，本研究结果表明:(l)从成年大鼠海马、纹状体等区域可分离出具有神经干细胞形态学特征和免疫学特性的细胞;(2) BMP4 加入培养液中可诱导体外培养的成年大鼠脑海马、纹状体等区域神经干细胞的胆碱能分化;(3) BMP4注入海马齿状回可诱导成年大鼠该区神经元的胆碱能表达的上调。提示BMP家族中的BMP4具有诱导神经干细胞胆碱能分化或表达的效应，值得在神经退行性病变等疾病的动物实验及临床治疗中进行进一步的研究。
【学位授予单位】：中国人民解放军军医进修学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R329

【相似文献】