胆汁酸分子与霍乱弧菌DsbA蛋白相互作用机制的研究

发布时间：2017-03-23 06:22

  本文关键词：胆汁酸分子与霍乱弧菌DsbA蛋白相互作用机制的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：霍乱弧菌为革兰氏阴性菌,是人类传染病霍乱的病原体,可引起感染者剧烈呕吐,腹泻,大量失水,甚至死亡。霍乱弧菌在宿主体内,只有进入肠道并定殖于小肠上皮细胞后,其致病性相关毒素基因tcp和ct才会被大量表达。通过对小肠提取物分离纯化分析发现,肠道中的胆汁酸分子通过霍乱弧菌的DsbA蛋白使毒素基因调控蛋白TcpP形成更多具有功能的二聚体结构,从而诱导产生大量的毒素因子。敲除DsbA的编码基因vcdsb A后,毒素基因的表达就不再受胆汁酸分子的诱导,而且TcpP不能形成二聚体。因此,推测当霍乱弧菌进入人体肠道后,首先利用胆汁酸分子与DsbA的相互作用调控下游毒素基因网络,从而产生大量的毒素因子。为研究胆汁酸分子与DsbA的相互作用,首先将霍乱弧菌的DsbA蛋白编码基因vc0034(vcdsb A)克隆至原核表达载体pET28a,转化E.coli Rosetta进行蛋白表达,并使用镍离子树脂纯化,得到霍乱弧菌DsbA蛋白。然后利用等温滴定量热(ITC)试验检测胆汁酸分子TC与DsbA的互作情况。结果表明,TC与DsbA互作的平衡解离常数KD为0.93×10-4 M,化学计量比n为1.17 Sites,焓变化ΔH为-3647 cal/mol,熵变化ΔS为6.22 cal/mol,二者反应热量变化很大且亲和力很强,说明DsbA与TC确实存在相互作用。为了进一步研究DsbA的生物学功能,进行了胰岛素还原酶试验,发现DsbA还原酶活性受TC抑制。为了进一步确定DsbA与胆汁酸分子互作的关键氨基酸位点,利用易错PCR的方法构建了突变文库,并通过检测含有pBBRLux荧光报告质粒的菌株的荧光表达冷光值的方法进行文库筛选,对突变的vcdsb A基因进行序列测定。最终,从近一万个突变株中筛选到dsbAH113L,dsb AD135V,dsb AE188A三个对TC不敏感的疑似株。为了进一步研究这三个位点的作用,在大肠杆菌中表达了DsbAH113L,DsbAD135V,DsbAE188A三个蛋白。结果发现它们在大肠杆菌dsbA缺失株中对TC较不敏感,但在霍乱弧菌dsb A缺失株中又变为较敏感,且TC影响突变体DsbA的还原酶活性,说明这些位点并不是DsbA与TC的互作位点,其具体作用机制需进一步探究。本论文进一步揭示了胆汁酸分子与DsbA相互作用的分子机制,为今后筛选抑制DsbA功能的小分子抑制剂奠定了试验基础。
【关键词】：霍乱弧菌 DsbA蛋白 胆汁酸分子 相互作用
【学位授予单位】：浙江农林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R378
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-10
• 第一章 霍乱弧菌研究概况10-17
• 1.1 霍乱流行概况10-11
• 1.2 霍乱弧菌的生物学性状11
• 1.3 霍乱弧菌毒力因子及其致病机理11-13
• 1.3.1 霍乱弧菌毒力岛VPI与噬菌体CTXΦ12
• 1.3.2 毒素协同菌毛TCP12-13
• 1.3.3 霍乱毒素CT13
• 1.4 霍乱弧菌的毒素调控网络13-15
• 1.4.1 ToxR调控元件14
• 1.4.2 ToxT调控14-15
• 1.5 二硫键氧化还原蛋白15-16
• 1.6 胆汁酸16
• 1.7 胆汁酸诱导TcpP二聚体形成16-17
• 第二章 霍乱弧菌DsbA蛋白表达纯化17-30
• 2.1 试验材料与仪器17-20
• 2.1.1 菌株与质粒17
• 2.1.2 试剂与溶液配制17-19
• 2.1.3 试验仪器19-20
• 2.2 试验方法20-27
• 2.2.1 蛋白原核表达重组质粒的克隆20-25
• 2.2.2 DsbA蛋白的表达纯化25-26
• 2.2.3 蛋白的透析26-27
• 2.3 试验结果与分析27-28
• 2.3.1 重组表达质粒的构建与鉴定27
• 2.3.2 重组蛋白的表达与纯化27-28
• 2.4 讨论28-30
• 第三章 等温滴定量热(ITC)试验与还原酶活性测定30-37
• 3.1 试验材料与仪器30-31
• 3.1.1 试剂与溶液30
• 3.1.2 试验仪器30-31
• 3.2 试验方法31-33
• 3.2.1 DsbA蛋白与胆汁酸互作分析ITC试验31-32
• 3.2.2 DsbA蛋白还原酶活性测定试验32-33
• 3.3 试验结果与分析33-35
• 3.3.1 ITC互作分析33-34
• 3.3.2 胰岛素还原酶活性测定34-35
• 3.4 讨论35-37
• 第四章 霍乱弧菌dsbA随机突变基因文库构建及突变株筛选37-49
• 4.1 试验材料与仪器37-38
• 4.1.1 菌株与质粒37
• 4.1.2 试剂与溶液37-38
• 4.2 试验方法38-44
• 4.2.1 随机突变库的构建38-41
• 4.2.2 dsbA突变株筛选41-44
• 4.3 试验结果与分析44-47
• 4.3.1 随机突变文库的构建44-46
• 4.3.2 疑似dsbA突变体定点突变46-47
• 4.4 讨论47-49
• 第五章 霍乱弧菌dsbA突变体表型分析、蛋白表达纯化及还原酶活性测定49-57
• 5.1 试验材料与仪器49
• 5.1.1 菌株与质粒49
• 5.1.2 试剂与溶液49
• 5.1.3 试验仪器49
• 5.2 试验方法49-50
• 5.2.1 dsbA突变体在AML65(pMH501,Ptox T-lux)和V.C ΔdsbA Ptox T-lux中的荧光表达及运动性验证49-50
• 5.2.2 dsbA突变体蛋白表达纯化50
• 5.2.3 dsbA突变体蛋白还原酶活性测定50
• 5.3 试验结果50-55
• 5.3.1 dsbA突变体在AML65(pMH501,Ptox T-lux)中的荧光表达及运动性验证50-52
• 5.3.2 dsbA突变体在V.C ΔdsbA Ptox T-lux中的荧光表达及运动性验证52-53
• 5.3.3 DsbA_(H113L)，DsbA_(D135V)，DsbA_(E188A)蛋白的表达纯化53-54
• 5.3.4 DsbA_(H113L)，DsbA_(D135V)，，DsbA_(E188A)蛋白还原酶活性测定54-55
• 5.4 讨论55-57
• 全文总结57-58
• 参考文献58-65
• 缩略词65-66
• 个人简介66-67
• 致谢67

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 Shyamapada Mandal;Manisha Deb Mandal;Nishith Kumar Pal;;Cholera:a great global concern[J];Asian Pacific Journal of Tropical Medicine;2011年07期

  本文关键词：胆汁酸分子与霍乱弧菌DsbA蛋白相互作用机制的研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：263143