鼠疫耶尔森氏菌多重PCR-微孔板杂交-EIA检测技术的研究

发布时间：2020-04-18 11:14

【摘要】：目的：建立鼠疫耶尔森氏菌防污染多重PCR—微孔板杂交—EIA检测鉴定技术用于鼠疫耶尔森氏菌的快速检测鉴定。 方法：针对分别存在于鼠疫耶尔森氏菌pMT1和pPCP1质粒上的毒力基因caf1和pla，以及一段276bp染色体序列3a分别设计引物，其中上游引物5’-末端生物素标记，建立多重PCR反应体系。用特别设计的三对引物制备捕获探针并分别包被聚乙烯微孔板，原则是探针的长度在400—700bp之间，且包含靶序列，以提高杂交检测效率。待鉴定标本用生物素化的三对检测引物多重PCR扩增，扩增体系中用UNG防止产物污染。同时检测caf1、3a和pla三个靶序列，相应扩增产物大小分别为171、276和480bp。扩增产物热变性后在预包被捕获探针的微孔板中严格条件下分别杂交和漂洗。信号检测系统采用链霉亲和素化的辣根过氧化物酶，以TMB作为底物，，显色反应结束后，2M H_2SO_4中止反应，在Hyperion Micro4酶标仪上读取OD450，阳阴OD比值≥2.1为阳性。 结果：应用该鉴定技术对我国鼠疫耶尔森氏菌17个生态型及新发现的青藏高原青海田鼠疫源地菌株的检测结果表明，多重PCR-电泳法检测结果，54株实验菌株均扩增出预期的3条产物带，相关菌株均阴性，检测灵敏度为100fgDNA；多重PCR-微孔板杂交检测结果，20株实验菌株全部阳性(OD450 0.151-0.967)，相关菌株均阴性(OD450 0.007-0.019)。其检测灵敏度为10fg DNA。 结论：该方法用于鼠疫耶尔森氏菌的鉴定简便、快捷，具有很高的特异性和敏感性，多重PCR-微孔板杂交检测的敏感性较多重PCR-电泳法检测的敏感性高10倍；所研制的防污染多重PCR—微孔板杂交—EIA试剂克服了目前PCR试剂运输不便，产物污染所致假阳性和判定结果欠客观的缺点，为鼠疫耶尔森氏菌的快速鉴定提供了有力手段。
【图文】：

用3a引物对我国17个生态型及1个待定的生态型共计275株鼠疫耶尔森氏菌PCR鉴定结果均呈单一的扩增带，与标准DNA分子量相比，其大小与预期设计的276bp一致(图3a，3b，3c)。对假结核耶尔森氏菌和小肠结肠炎耶尔森氏菌等近缘及相关菌株进行检测均阴性。表明该引物用于鼠疫耶尔森氏菌检测具有很高的特异性。图3a17个生态型及1个待定的生态型鼠疫耶尔森氏菌PCR电泳结果1一96实验菌株(表3中前%个样本)鉴定全部阳性。中间产物带为阳性对照(276bP)。FIG3aAgarosegeleleetroPhoresisPattemsshowingPCRamPlifieationProductsfrom96differentYPestisstains.Lane1to96XPesrisstrainsPCRamPlieons(rePresentativeoftheformer96strainsofTable.1:The276bPProduetshowsinthemiddleLanewasPositiveeontrol.

图3bl7个生态型及1个待定的生态型鼠疫耶尔森氏菌PCR电泳结果96实验菌株(表3中间%个样本)鉴定全部阳性。中间产物带为阳性对照(276bp)和分子量Marker(100，300，500，700)FIG3bAgarosegeleleetroPhoresisPattemsshowingPCRamPlifieationProduetsfrom96differentYPestisstains.Lane1to96YPestisstrainsPCRamPlieons(RePresentativeofthemiddle96strainsofTable.l):TheProduetsshowinthemiddleLaneWaS276bPPositiveeontrolandDNAmoleeularsizemarker(100一bPladder)SeParately.
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2003
【分类号】：R378


本文编号：2632039