胶质细胞源性神经营养因子受体alpha1结构与功能关系的探讨

发布时间：2020-04-22 01:56

【摘要】：胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)对多巴胺能神经元、运动神经元、感觉神经元和肠道神经元等多种神经元具有促进存活及保护作用；促进肾脏的发育和精原细胞的成熟。因此，其极有希望被用于治疗神经损伤和神经系统退行性病变等疾病。GDNF的神经营养作用主要是通过两类受体亚基介导，即胶质细胞源性神经营养因子受体alpha(GFRαs)亚基和受体酪氨酸激酶RET亚基。GFRαs亚基是靠其C-末端的磷酯酰肌醇键(GPI)锚定在细胞膜外表面的膜外蛋白，它不能直接转导信号。传统观点认为，GDNF首先与GFRα1结合形成GDNF-GFRα1复合物，此复合物再与RET结合形成三聚体复合物，并引起RET的二聚化和酪氨酸残基自磷酸化，从而引起下游的信号转导。后来的研究发现，在某些细胞上，不需GDNF刺激，GFRα1与RET即有弱结合。RET可增强GDNF与GFRα1的亲和力。关于GDNF分子中与GFRα1结合并产生生物学效应的位点目前已研究得比较清楚。但关于GFRα1分子的结构与功能的关系目前尚未见报道。如果能阐明GFRα1分子结构与功能关系，可以深入认识GDNF神经营养作用的分子机制，为设计具有神经营养作用的小分子多肽提供靶标；也可以促进GDNF治疗帕金森病等神经退行性疾病的研究进程。 肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC12)是被广泛用于研究神经营养因子作用的细胞模型。不同的神经营养因子可引起PC12细胞增值或分化的不同表型变化。PC12细胞不表达GDNF受体alphal(GFRα1)，而只表达低水平的RET。 本研究采用RT-PCR、重组DNA技术，构建大鼠GFRα1表达质粒，在大肠杆菌中实现大鼠GFRα1的高效表达，并通过金属螯和层析技术纯化重组蛋白。然后，通过进化踪迹分析、同源序列联配及计算机软件模拟GFRα1的二级结构，计算氨基酸残基的保守性、亲疏水性和溶剂可及面积，选定缺失突变的区域。利用细胞转染技术，，构建了PC12-GFRα1、PC12-RET、PC12-GFRα1-RET和PC12-GFRα1Mn-RET(Mn：GFRα1各突变体)等一系列的基因工程细胞株。通过观察GDNF对PC12各突变体基因工程细胞株存活和分化影响并结合Western-blot检测结果，确定GFRα1中与GDNF结合并产生生物学功能的重要功能区域。本研究主要结果如下： 中文摘要 1.GFRal基因的克隆、表达及活性蛋白的获得 从新生4d SD大鼠海马组织中提取总RNA，通过RT一PCR，扩增出GFRal cDNA。将GFRal CDNA克隆至含T7启动子的质粒pET一28a(+)中，构建表 达质粒pET一GFRal，转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得表达菌株BLGFRal。表 达菌株经IPTG诱导后，SDS一PAGE检测GFRal蛋白表达，并形成包涵体一。用 Ni2+一NTA树脂纯化并在Ni2+一柱上复性后，纯度达90写以上。 2.GDNF的表达及其对PC12基因工程细胞的影响 将表达质粒pET一GDNF转化大肠杆菌BLZI(DE3)，经IPTG诱导后在 M2+一NTA柱上进行纯化，稀释复性后，纯度达90%以上。利用细胞转染技术， 把peDNA3.0一GFRal、peDNA3.0一RET及peDNA3.0一GFRal+peDNA3.0- RET质粒分别转染入PclZ细胞，G418筛选稳定克隆，构建Pc12工程细脉株。 用GDNF分别刺激工程细胞，3天后观察其存活和分化情况。纯化和复性后的 重组GDNF蛋白，可显著增强PC12一GFRal一RET工程细胞的存活和分化;对 PC12一RET工程细胞没有任何作用;对PC12一GFRd的存活和分化作用显著强 于对PC12--RET的作用，但也显著低于对PC12一GFRal一RET细胞的作用，初 步明确GDNF对PC12细胞的营养作用必须经GFRal介导并有RET参与。 3.GDNF家族及其受体GFRas家族的进化踪迹 用进化踪迹分析方法，对GDNF家族及其受体GFR家族进行进化分析; 利用ClustalX一Vl.81构建该家族的多重序列联配和进化树;利用PHD预测 GFRas的二级结构及其残基的溶剂可及性，从而绘出T GFRas二级结构模式 图，并进一步确定突变区域和突变位点。 4.GFRal结构与功能分析 利用PCR和DNA重组技术，在GFRQs二级结构预测的墓础上，对G到Ral 分别进行了N一端、G端、C一端螺旋和中央区的缺失突变。在大肠杆菌中分别表 达这四个突变体。利用PC12细胞的存活和分化情况，分别观察这四个突变体 对介导GDNF神经营养作用的影响。结果发现GFRa1N一端对介导GDN护的 曹养作用不重要;C一端靠近中央区的螺旋对介导GDNF的营养作用则是必需 的;中央区对介导GDNF的神经营养作用非常重要。
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2003
【分类号】：R346

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本文编号：2635997