恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶基因的克

发布时间：2020-04-24 14:49

【摘要】： 疟疾是广泛流行于热带、亚热带及温带边缘的一种重要虫媒传染病，极大地威胁着人类的健康。疟疾的早期诊断和早期正规治疗是WHO和我国疟疾控制的研究重点，其意义在于不仅能够降低重症病人和死亡的发生，还能防止其传播，延缓疟原虫对抗疟药产生抗性。疟疾流行区由于熟练镜检技术人员及设备缺乏，仅依靠传统厚薄血膜镜检法已越来越不能适应当前疟疾诊断的需要。八十年代以来随着分子生物学的发展而出现的基因诊断技术(分子杂交，PCR、套式PCR、荧光定量PCR等)，显示了较高的敏感性和特异性，可以对疟原虫的感染作出早期快速诊断，但需要更复杂的仪器设备和技术条件作为支持，难以在基层推广应用。近年来以检测疟原虫合成并分泌的特异性抗原为基础的免疫学方法，尤其是以单抗为基础的Dipstick技术，由于其操作简便、快速，结果易于判定，已成为疟疾诊断研究的发展方向。目前疟原虫相对特异的富组氨酸蛋白Ⅱ(HRPⅡ)和乳酸脱氢酶(LDH)正被应用于疟疾的诊断，现场评估显示出了较好的效果。近年来研究揭示，疟原虫GDH同脊椎动物组织的GDH在理化、生物学特性及酶学方面有较大差异，如疟原虫GDH活性不受嘌呤核苷酸(GTP、ADP)的影响，而脊椎动物组织的GDH可被GTP、ADP激活或抑制；疟原虫GDH特异地以辅酶Ⅱ为其辅酶，而脊椎动物组织的GDH可以辅酶Ⅰ或Ⅱ作为辅酶。临床和实验研究证据表明，疟原虫比其宿主细胞更易受氧化压力影响，因此参与巯基代谢及参与还原型辅酶Ⅱ(NADPH)再生的脱氢酶对于疟原虫免受宿主体内氧化剂损伤及维持生存起着极其重要的作用。疟原虫GDH被认为是NADPH生成的主要来源，而且更为重要的是，宿主红细胞内没有此酶(GDH—NADP~+)。另外，李林海：恶付疟原虫谷氨酸脱氢酶基因的克隆、表达及产物抗原活性研究免疫学研究初步表明疟原虫GDH可能具有一定的种、属特异性。近两年有人通过在疟疾感染者血浆和疟原虫培养上清中利用变形杆菌GDH交叉抗体检测该抗原或测定该酶活性来诊断恶性疟原虫感染，取得了较满意的结果，提示该酶有望成为一种疟疾新型诊断分子。同时，，由于疟原虫GDH也仅山活虫体产生，血液中GDHp的水平与虫体血症呈平行相关，因此还可用之来监测感染过程和抗疟药物的治疗效果。本研究利用PCR技术钓取了恶性疟原虫海南株OCC／n们谷氨酸脱氢酶编码基因，克隆入pGEX－4T＊表达载体，测定的序列与恶性疟原虫 Thailand株GDH基因序列进行比较，其推导的氨基酸序列与不同物种的 GDH序列进行同源性分析，以探讨恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶（GDHpfl独特的理化、生物学及酶学特性的分于机制。并在大肠杆菌 BLZI中进行了诱导表达，纯化重组蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体，运用ELISA、 Western．blot进行抗原性分析，为下一步筛选单抗用于GDH免疫胶体金诊断试剂仰ICA）盒的研制奠定基础。结果显示，利用PCR技术成功地钓取了编码我国恶性疟原虫海南株 oCC lffl：N）谷氨酸脱氢酶的基因序列。将GDHpf基因克隆到pG职－4T上表达质粒，经PCR、限制性酶切分析等鉴定，构建了PGEX－GDH重组表达质粒，首次测定了编码我国恶性疟原虫海南株历CC l／HN）谷氨酸脱氢酶编码基因的全序列，大小为1413hp，无内含子。恶性疟原虫海南株 GDH基因与Thailand株GDH基因相比，两者同源性高达99．86O，仅存在2个点突变，且均为同义突变，两者推导的氨基酸序列完全相同，说明该基因在不同的恶性疟原虫株之间高度保守。同源性分析结果表明，恶性疟原虫海南株GDH氨基酸序列与人的GDH同工酶、蓝氏贾第鞭毛虫、克鲁氏锥虫和细菌GDH相比，同源性较低，即使与BLAST检索出的具有最高同源性的蓝氏贾第鞭毛虫相比，也仅有57．90％的氨基酸残基相同，因此，疟原虫GDH明显不同于其它生物GDH。重组质粒在大肠杆菌中表达出GDHpf与谷眯甘肽S－转移酶（GST）的融合蛋白，表达产物主要以包涵体形式存在，重组蛋白分子量约为 66KDa，表达量约占菌体总蛋白的 13石％，用鼠抗恶性疟原虫免疫血清对表达产物进行Western－blot分析，发现特异性区带出现在66kDa处，表明该蛋白确实是所要表达的GST融合蛋白。进一步用制备电泳法纯化－3－第一军医大学硕士学位论文的表达产物免疫小鼠制备免疫血清，ELISA和Western七＊分析表明该兔疫血清能与恶性疟原虫和间日疟原虫49ica处的虫源蛋白起反应，而与刚地弓形虫、日本血吸虫及未感染的红细胞不发生交叉反应，说明重组蛋臼中包含有所需的抗原表位且具有良好的抗原活性。这就为下一步筛选单抗用于GDH免疫胶体金诊断试剂（GICA）盒的研制奠定了基础。
【图文】：

恶性疟原虫,基因组,PCR扩增

一、GDHPf基因的扩增用Pl和PZ两条引物扩增恶性疟原虫FCCI/HN株GDH基因，PCR产物经1%琼脂糖电泳显示，在约1430bP处有一特异扩增条带(图1一l)，分子量大小与已报道的恶性疟原虫Thailand株GDH一致[4‘]。15001000图1一1.恶性疟原虫基因组PCR扩增结果M.分子量标准(DNAladder);1，2.PcR产物;3.阴性对照Figl一1.TheresultofthegenomieDNAofP.falciParumbyPCRM.Marker(DNAladder);l，2.PCRProduets;3.Negativeeontrol二、重组克隆的筛选及鉴定PCR产物经酚一氯仿抽提，乙醇沉淀后用Ec口R卜Sall进行双酶切，载体pGEx一4T一1经EcoR卜sall双酶切后回收大片段，将PcR扩增后的酶切回收产物定向连接到载体中，转化大肠杆菌TGI。从转化平板上挑取9个单菌落

重组质粒,初步筛选,质粒,产物

UnrecombinantPlasmids:2一6.ReeombinantPlasmids唱500却图1一pGEx一GDH重组质粒的PcR鉴定M.分子量标准(DNAladder);1.PcR产物;2.pGEX礴T一1扩增产物;3一又pGEx一ooH扩增产物Figl一3.Iden朋eationofreeombinantPGEX一GDHPlasmidbyPCRM.Marker(DNAladder);1.Productsal刀PlifiedfromgenomieDNA之ProduetsamPlifiedfromPGEX-4T一13一7.ProduetsamPlifiedfromPGEX一GDH
【学位授予单位】：第一军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2002
【分类号】：R392

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