抗凝血酶Ⅲ在巴斯德毕赤酵母中的表达及DNA改组研究

发布时间：2020-04-26 12:57

【摘要】： 抗凝血酶Ⅲ(antithrombinⅢ，AT—Ⅲ)是一种抗凝血糖蛋白，对维持血凝平衡起重要作用，其缺乏易导致血栓形成。血浆中提取的AT—Ⅲ浓缩物广泛应用于临床。但是，在爱滋病、肝炎等血液传播性疾病肆虐的今天，血液制品的安全性成为人们关注的重要问题。所以，利用基因工程的方法表达人重组抗凝血酶Ⅲ已成为一种发展趋势。 本课题用巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统对AT—Ⅲ基因进行表达。具体内容包括下面几部分：(1)载体的构建。利用计算机程序进行引物设计，由真核细胞载体pcDNA3.1—ATⅢ中扩增AT—Ⅲ基因，两种引物设计使重组AT-Ⅲ信号肽分别采用两种形式：宿主的信号肽和AT—Ⅲ天然信号肽。扩增的AT—Ⅲ cDNA测序正确后，装入pPIC9K，构建重组表达载体pPIC9K-AT。(2)转化和表达。将构建好的载体利用电穿孔仪转入巴斯德毕赤酵母中表达，测活。利用SDS-PAGE及Western blot鉴定。结果表明，表达活性良好。并对表达培养基的条件进行了优化。(3)纯化。将发酵液离心，上清经0.22μm膜过滤，采用亲和层析法(肝素亲和层析柱)，将产物初步纯化，产物纯度可达95％以上。(4)AT-Ⅲ的DNA改组研究。将AT-Ⅲ基因以DNAase Ⅰ部分酶解，经无引物和有引物两步PCR扩增，形成与原基因大小相似的改组基因库，再转入毕赤酵母中表达，筛选高表达株，已筛到15株。所以，我们成功地在巴斯德毕赤酵母中表达了AT-Ⅲ，，并对其进行了DNA改组的初步研究。
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2003
【分类号】：R346

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本文编号：2641521