受体型蛋白酪氨酸磷酸酶PCP-2与β-catenin的相互作用及其在细胞粘附和迁移中的作用

发布时间：2020-04-28 15:34

【摘要】： 由蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPs)和蛋白酪氨酸激酶(PTKs)共同动态调节的可逆性蛋白酪氨酸磷酸化反应在调节细胞生长、分化、代谢、存活、细胞周期、细胞间相互联系、细胞运动、基因转录、离子通道的活性、免疫应答等多种重要生命活动中具有重要作用。由于许多PTKs是癌基因和生长因子受体，因此已得到了广泛而深入的研究，但PTPs的重要性直到最近十几年才得到充分的认识。按照结构特点，PTPs被分为跨膜的受体型PTPs（R-PTPs）和可溶的胞浆型PTPs。前者又被分成七类，其中第II和III类R-PTPs的胞外区含免疫球蛋白样结构域（Ig-like domain）和III型纤连蛋白样结构域（FN-III repeats），与细胞粘附分子的胞外区具有相似性，表明其有可能参与调节细胞粘附。事实上，目前已证实PTPμ，PTPκ可通过其胞外区的同源性结合介导细胞粘附。 本课题研究的PCP-2是王红阳教授等于1996年在胰腺癌细胞株中克隆并鉴定的一个R-PTPs家族的新成员，cDNA全长5581 bp，编码一个含1430个氨基酸的具有磷酸酶活性的蛋白，与PTPμ，PTPκ具有较高的同源性，属于IIB型R-PTPs。其胞内区含两个磷酸酶结构域和一个相对较长的近膜区，该区与cadherins保守的胞内区具有一定的同源性，是cadherins与catenins相互作用所必需的，cadherins通过catenins的作用而与肌动蛋白细胞骨架作用，参与对细胞粘附的调节。越来越多的证据表明可逆的酪氨酸磷酸化是调节cadherins-catenins复合体的粘附功能的重要机制。到目前为止，对PCP-2的进一步研究的报道很少，关于PCP-2与catenins的相互作用以及PCP-2对细胞粘附迁移能力的影响还未见报道。 WP=5 本研究课题旨在通过应用Western Blot、Northern Blot、免疫共沉淀、定点突变和缺失突变、基因转染等技术，研究PCP-2在真核细胞中的表达，比较PCP-2与PTPκ、PTPμ等同类分子在表达上的差别。然后从mRNA和蛋白表达水平研究PCP-2表达水平与细胞密度的关系，初步探讨PCP-2对细胞接触聚集的影响。继之，采用基因转染和免疫共沉淀技术研究PCP-2与β-catenin在细胞中的相互作用。明确二者可直接结合后，通过获得PCP-2的EXT 、(C1C2 、(C2等一系列缺失突变体分析二者作用的结构基础，通过构建PCP-2两个磷酸酶结构域的定点突变体分析PCP-2对β-catenin的去磷酸化作用，进一步推理PCP-2与β-catenin相互作用的可能机制，为深入研究PCP-2对细胞粘附迁移能力的影响提供线索。最后采用Western Blot技术筛选一个PCP-2表达缺失的细胞系，直接观察PCP-2转染该细胞系后对细胞粘附迁移能力的影响。 本实验室采用Western Blot 技术分析PCP-2在真核细胞中的表达，发现在内源性表达PCP-2的WRL68细胞和外源性表达PCP-2的COS-7细胞中均只检测到一个大小约为180 KDa的特异蛋白带，无任何水解的蛋白片段，与PTPκ，PTPμ等同类分子具有显著差异。 采用Northern Blot和Western Blot 分析PCP-2的表达水平与细胞密度的关系，发现PCP-2在mRNA和蛋白水平的表达均随着WRL68细胞的密度增加而上升。100 %汇合率的WRL68细胞的PCP-2 mRNA表达水平是30 %汇合率细胞的3倍,而蛋白表达水平则上升至5.5倍，上升幅度明显高于mRNA 水平。提示PCP-2的表达受转录水平和转录后水平共同调控，可能具有调节和稳定细胞-细胞连接的作用。 通过表达并纯化六组氨酸融合的β-catenin C-端融合蛋白，免疫新西兰大白兔获得抗β-catenin C-端的多克隆抗体。鉴定显示：该抗体适用于Western Blot和免疫沉淀技术，效价约为1：500。为进一步研究PCP-2与β-catenin的相互作用提供了有效工具。运用基因转染和免疫共沉淀技术研究PCP-2与β-catenin的相互作用，证实PCP-2与β-catenin可直接结合，而且经过将PCP-2、β-catenin和/或SrcY527F共转染BHK-21细胞，或者用EGF刺激共转染了PCP-2 和β-catenin的BHK-21细胞，发现PCP-2与β-catenin的结合与β-catenin的磷酸化状态无关。通过限制性内切酶酶切或PCR技术获得PCP-2的一系列缺失突变体 WP=6 PCP-2 EXT， PCP-2 ?C1C2和PCP-2 ?C2，采用基因转染和免疫共沉淀技术，明确了PCP-2的近膜区是PCP-2与β-catenin相互作用所必需的。采用mega-primer方法获得PCP-2两个磷酸酶结构域的核心氨基酸Cys的定点突变体PCP-2 C1069S，PCP-2 C1364S，与β-catenin和/或SrcY527F共转染BHK-21细胞，结果显示PCP-2可使β-catenin去磷酸化，而且N-端近膜的磷酸酶结构域具有大部分或全部磷酸酶活性，C端的磷酸酶结构域几乎没有或者只有很少的磷酸酶活性。提示：β- catenin是PCP-2的一个底物。 用Western Blot筛选到PCP-2表达缺失的BHK-21细胞，采用基因转染技术将PCP-2基因稳定转染至BHK-21后发现：PCP-2基因转染抑制BHK-21细胞的迁移能力，选择性促进BHK-21细胞对特异性粘附底物的粘附作用。 本研究结果表明：PCP-2在真核细胞中只表达一个蛋白，而无水解片段，PCP-2表达水平随着细胞密度增加而上升。PCP-2通过其近膜区与β-catenin结合而相互作用，使β-catenin去磷酸化。生物学研究显示PCP-2能抑制细胞迁移，促进细胞的粘附能力。
【图文】：

.3.1. 构 建 PCP-2 胞 内 区 各 结 构 域 的 缺 失 突 变 体 取 抽 提K5RS-PCP-2 质粒和 pBSK 质粒各 4 μg，，用 XbaI 和 HindIII 双酶切，回收酶得的大小约 5.58 kb (PCP-2)和 2.98 kb(双酶切后完全线性化的 pBSK)的片段酶切所得的 PCP-2 cDNA 和 pBSK 片段用 T4 连接酶于 22 °C 连接 1 h。连接转化宿主菌 XL1-Blue,如前所述鉴定出正确的 pBSK-PCP-2 克隆(以aI+HindIII 酶切观察到 2.98 kb 和 5.58 kb 两条带为正确)。该质粒的限制性位点分布如图 1 所示。

PCP-2点突变体相对位置示意图
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2002
【分类号】：Q55

【共引文献】

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本文编号：2643608