microRNAs在人骨髓间充质干细胞向汗腺样细胞分化中的作用研究

发布时间：2017-03-23 23:19

本文关键词：microRNAs在人骨髓间充质干细胞向汗腺样细胞分化中的作用研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：【研究目的】1、利用胰蛋白酶-EDTA消化液分离纯化原代培养的汗腺细胞,为下一步诱导实验做准备;2、筛选人骨髓间充质干细胞和汗腺样细胞之间差异表达的microRNAs,并利用生物信息学进行差异表达microRNAs的靶基因预测,寻找人骨髓间充质干细胞向汗腺样细胞分化的关键调控microRNAs,并初步预测其功能;3、探索microRNAs在人骨髓间充质干细胞向汗腺样细胞分化中的作用。【研究方法】1、采用II型胶原酶溶液消化皮肤并分离出汗腺细胞团;2、采用胰蛋白酶-EDTA消化液分离纯化原代培养的汗腺细胞,并进行免疫组化鉴定培养的细胞,同时进行皮肤HE染色观察正常人皮肤中的汗腺形态结构;3、对成骨细胞、成脂肪细胞诱导分化液诱导后的人骨髓间充质干细胞分别进行茜素红、油红O染色,鉴定人骨髓间充质干细胞的多向分化能力。采用Transwell培养板构建人骨髓间充质干细胞和热休克汗腺细胞间接共培养诱导分化模型,并利用免疫荧光、RT-PCR和Western Blot技术对诱导后的人骨髓间充质干细胞进行汗腺细胞表面标志物的检测;4、提取人骨髓间充质干细胞和汗腺样细胞的总RNA并作纯化标记,然后进行microRNAs芯片杂交并利用生物信息学进行靶基因预测,采用实时荧光定量PCR进行芯片结果的验证,初步确定汗腺发育有关的microRNAs;5、将化学合成的特定的microRNAs mimics、microRNAs inhibitor、microRNA Negative Control分别转染人骨髓间充质干细胞并继续与热休克的汗腺细胞间接共培养诱导7天,之后采用免疫荧光、RT-PCR和Western Blot技术检测特定microRNAs mimics、microRNAs inhibitor、microRNA Negative Control转染后并间接共培养诱导的效果。【研究结果】1、经胰酶-EDTA消化液分离纯化后,去除了新生汗腺细胞周围95%以上的成纤维细胞,得到了高纯度的原代培养的汗腺细胞。2、人骨髓间充质干细胞诱导后汗腺细胞表面标志物cea、ck8、ck19表达阳性。3、经过对micrornas芯片结果对比分析,人骨髓间充质干细胞和其诱导分化来源的汗腺样细胞之间micrornas表达水平绝对值相差2倍以上的micrornas有68个,其中上调的有19个,下调的有49个。表达水平上调相差5倍以上的micrornas有microrna-132-3p、microrna-4467、microrna-4484、microrna-146a-5p、microrna-6126等5个。表达水平下调相差5倍以上的micrornas有microrna-708-5p、microrna-138-5p、microrna-6812-5p、microrna-138-1-3p、microrna-1281、microrna-3157-3p、microrna-4298、microrna-4459等8个。4、实时荧光定量pcr检测结果与micrornas芯片结果一致。5、生物信息学靶基因预测分析显示:在这些差异表达的68个micrornas中,有18个micrornas靶向于已知的汗腺生长发育相关的nf-κb信号通路、mapk/erk信号通路、wnt/β-catenin信号通路和eda/edar信号通路中的多个基因。且microrna-138-1-3p改变明显并与汗腺发育eda/edar信号通路中的eda基因有关。6、microrna-138-1-3pmimics转染间接共培养组较micrornanegativecontrol转染间接共培养组的eda基因表达减弱,形成的cea、ck19阳性细胞数量较少;microrna-138-1-3pinhibitor转染间接共培养组较micrornanegativecontrol转染间接共培养组的eda基因表达增强,形成的cea、ck19阳性细胞数量较多。【研究结论】1、经过胰酶-edta消化液差速消化法得到了高纯度的原代培养的汗腺细胞;2、通过间接共培养诱导分化模型,能够诱导人骨髓间充质干细胞向汗腺样细胞分化;3、人骨髓间充质干细胞和其诱导分化来源的汗腺样细胞之间有68个差异表达的micrornas,这些差异表达的micrornas可能在人骨髓间充质干细胞向汗腺样细胞分化过程中起作用;4、microrna-138-1-3p作用于eda/edar信号通路中的eda基因参与调控人骨髓间充质干细胞向汗腺样细胞分化。
【关键词】：间充质干细胞 汗腺 microRNAs 基因表达谱
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R329.2
【目录】：

中文摘要4-7
Abstract7-12
缩略语/符号说明12-14
前言14-17
研究现状、成果14-16
研究目的、方法16-17
一、培养汗腺细胞的纯化及hBM-MSCs诱导分化为汗腺样细胞的研究17-39
1.1 对象和方法17-31
1.1.1 标本来源17
1.1.2 主要仪器设备17-18
1.1.3 主要实验试剂18-22
1.1.4 实验方法22-31
1.2 结果31-36
1.2.1 骨髓间充质干细胞向成骨、成脂细胞分化31-32
1.2.2 人汗腺的分离培养及形态学观察32-33
1.2.3 培养人汗腺细胞的纯化及免疫组化鉴定33-34
1.2.4 共培养体系诱导hBM-MSCs来源的汗腺样细胞形态学观察及表型鉴定34
1.2.5 汗腺发育表面标志基因的水平改变34-35
1.2.6 汗腺发育表面标志蛋白的水平改变35-36
1.3 讨论36-38
1.3.1 汗腺的分离培养及纯化36-37
1.3.2 hBM-MSCs诱导分化为汗腺样细胞的模型构建37-38
1.4 小结38-39
二、microRNA1381-3p在hBM-MSCs诱导分化为汗腺样细胞中的作用研究39-57
2.1 对象和方法39-47
2.1.1 主要仪器设备39
2.1.2 主要实验试剂39-41
2.1.3 实验方法41-47
2.2 结果47-54
2.2.1 hBM-MSCs和其来源的汗腺样细胞micro RNAs差异表达谱及靶基因预测47-49
2.2.2 microRNAs差异表达谱的验证49
2.2.3 microRNA1381-3p转染及转染效率的检测49-50
2.2.4 microRNA1381-3p转染后细胞表型的变化50-51
2.2.5 microRNA1381-3p转染后其靶基因及蛋白的变化51-54
2.3 讨论54-56
2.3.1.hBM-MSCs和其来源的汗腺样细胞microRNAs差异表达谱及靶基因预测分析54-55
2.3.2.microRNA1381-3p在hBM-MSCs向汗腺样细胞诱导分化中的作用55-56
2.4 小结56-57
结论57-58
参考文献58-62
发表论文和参加科研情况说明62-65
综述65-75
综述参考文献71-75
致谢75

【相似文献】

中国期刊全文数据库前10条

1 李培旺;卢向阳;李昌珠;方俊;田云;;植物microRNAs研究进展[J];遗传;2007年03期

2 任景怡;许宁;韩冠平;陈红;;microRNAs参与动脉粥样硬化疾病的发生[J];中国生物化学与分子生物学报;2011年06期

3 陈旭;李晚忱;付凤玲;;玉米microRNAs及其靶基因的生物信息学预测[J];遗传;2009年11期

4 王迪;傅彬英;黎志康;张立军;;microRNAs在植物发育调控中的功能研究进展[J];分子植物育种;2006年05期

5 李永庆;徐建震;孟志刚;李永进;;染色体上聚集的microRNAs具有更多共同的靶基因[J];生物物理学报;2007年06期

6 宋军营;李晔;白洁;;microRNAs在糖代谢和脂代谢中的作用[J];中国老年学杂志;2013年21期

7 朱霓;秦永文;荆清;;microRNAs:心血管疾病重要的调控因子[J];生命科学;2008年02期

8 董园园;李海燕;李校X;杨树林;;红花microRNAs靶基因的生物信息学预测[J];中国生物工程杂志;2012年10期

9 边春景;刘铁刚;刘霞;邵荣光;;microRNAs在动物体内的功能[J];医学分子生物学杂志;2005年05期

10 吴刚;王丹;黄毅;韩敬东;;衰老相关microRNAs研究进展[J];生物化学与生物物理进展;2014年03期

中国重要会议论文全文数据库前10条

1 王芸;陶筱川;吕应堂;;水稻MicroRNAs在水稻发育过程中的功能研究[A];湖北省植物生理学会第十五次学术研讨会论文集[C];2007年

2 周宁;陈宝元;曹洁;汤华;刘民;邓园;王彦;;microRNAs在阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征患者血清中的表达及意义[A];中华医学会呼吸病学年会——2013第十四次全国呼吸病学学术会议论文汇编[C];2013年

3 韦晖;王成;范钰;许琪;张辰宇;沈岩;;偏执型精神分裂症血浆microRNAs表达谱的筛查[A];第七届全国医学生物化学与分子生物学和第四届全国临床应用生物化学与分子生物学联合学术研讨会暨医学生化分会会员代表大会论文集[C];2011年

4 单志新;余细勇;林秋雄;符永恒;邓春玉;杨敏;林曙光;;microRNAs、炎症因子及其受体基因在自发性高血压大鼠中的表达[A];第九届全国心血管药理学术会议论文集[C];2007年

5 郭士伟;刘蔼民;;小RNA(MicroRNAs)的发现、结构和功能[A];2006年中国植物逆境生理生态与分子生物学学术研讨会论文摘要汇编[C];2006年

6 郑宗基;刘晓萌;张雷;赵倩伟;李晨钟;薛耀明;;β3肾上腺素受体激动剂对C57BL/6J小鼠脂肪组织棕色化相关基因和microRNAs的影响[A];中华医学会第十二次全国内分泌学学术会议论文汇编[C];2013年

7 李海怡;高璐;左洪亮;钟国华;;昆虫microRNAs功能研究进展[A];公共植保与绿色防控[C];2010年

8 刘红;韩璐璐;谢爽;娄莹;蒋娟娟;田蕾;许莉;李一石;;连续口服厄贝沙坦对健康中国志愿者血浆MicroRNAs表达的影响[A];中国心脏大会（CHC）2011暨北京国际心血管病论坛论文集[C];2011年

9 方巧云;杨森;张学军;;MicroRNAs及其在皮肤病上的应用[A];中华医学会第14次全国皮肤性病学术年会论文汇编[C];2008年

10 韩璐璐;刘红;康健;边文彦;庞会敏;李一石;;冻存血浆中MicroRNAs稳定性评价[A];中国心脏大会（CHC）2011暨北京国际心血管病论坛论文集[C];2011年

中国博士学位论文全文数据库前10条

1 詹芸;MicroRNAs在乳腺癌侵袭转移过程中的功能与机制研究[D];北京协和医学院;2015年

2 周可树;MicroRNAs在慢性淋巴增殖性疾病中的表达及其在慢性淋巴细胞白血病预后中的意义研究[D];中国协和医科大学;2010年

3 刘雯静;胰腺癌特异性microRNAs的筛选及机制研究[D];北京协和医学院;2011年

4 于双妮;胰腺癌差异表达microRNAs的鉴定及功能研究[D];北京协和医学院;2008年

5 熊薇;微泡microRNAs在肝癌诊断及发病机制中的作用研究[D];华中科技大学;2012年

6 陈娜;STAT3介导microRNAs调控的IL-9过表达在慢性淋巴细胞性白血病免疫调节机制中的研究[D];山东大学;2014年

7 高刚;氡致肺癌及肺损伤相关microRNAs的研究[D];中国疾病预防控制中心;2010年

8 张彩彩;硫化氢通过microRNAs调控血管新生的机制研究[D];复旦大学;2011年

9 孔维威;一氧化碳调节拟南芥缺铁反应及缺铁响应microRNAs的鉴定[D];南京农业大学;2009年

10 顾艳斐;一、microRNAs对肺癌细胞系生物学行为的影响及非小细肺癌组织中microRNA的表达与NSCLC预后及TKIs疗效的分析二、x-TAG液相芯片技术检测126例中国人非小细胞肺癌EGFR、B-Raf、K-Ras基因突变情况研究及临床疗效的相关性分析[D];北京市结核病胸部肿瘤研究所;2013年

中国硕士学位论文全文数据库前10条

1 谭志军;microRNAs在人骨髓间充质干细胞向汗腺样细胞分化中的作用研究[D];天津医科大学;2015年

2 张继磊;炎症相关因子和microRNAs在胃MALT淋巴瘤中发病机制的探讨[D];第二军医大学;2012年

3 罗晓燕;桃microRNAs鉴定及内参基因的筛选[D];南京农业大学;2013年

4 肖玲;胚胎干细胞RNAs与microRNAs相互作用网络研究[D];华中师范大学;2012年

5 罗书芳;干旱胁迫下丹参microRNAs差异表达谱分析[D];陕西师范大学;2013年

6 张译云;毛白杨低温胁迫相关microRNAs的鉴定及差异表达分析[D];北京林业大学;2012年

7 李楠楠;小麦microRNAs的序列分析与验证[D];西北农林科技大学;2008年

8 张小庆;水稻MAPKKs基因功能鉴定和microRNAs靶模拟材料构建[D];华中农业大学;2011年

9 王克义;血清microRNAs在甲状腺乳头状癌中的临床应用研究[D];浙江大学;2015年

10 李伟;microRNAs介导的去甲基化抑制胃癌细胞B7-H1的表达[D];华中科技大学;2011年

本文关键词：microRNAs在人骨髓间充质干细胞向汗腺样细胞分化中的作用研究，由笔耕文化传播整理发布。