乙型肝炎病毒（HBV）颗粒性抗原转基因番茄植株的构建及鉴定

发布时间：2020-05-10 07:24

【摘要】：病毒性乙型肝炎是世界范围内一个严重的公众健康及社会问题，全世界约有4亿HBV患者及病毒携带者，我国现HBV携带者约为1.2亿人。以IFN-α为主的药物治疗效果并不理想，且费用高、疗程长、停药后易复发及长期治疗易产生耐药性。目前最有效、最经济预防和控制HBV的措施是疫苗接种，但现在的HBV基因工程疫苗存在一定低应答率问题。当务之急是研制一种有效、安全、经济、使用方便的新型疫苗。 植物基因工程技术的不断发展为新型疫苗的研究提供了新的解决方法。植物表达系统具有高效、价廉及使用方便等特点。已取得的成果和进展表明，植物表达系统生产的抗原可保持自然免疫原性，口服后能够诱发体液和粘膜免疫反应。 由于pre-S1及pre-S2在HBV与肝细胞受体的粘附中起重要作用，而且在自然感染状态下抗pre-S2抗体的产生要早于抗S抗体。pre-S1及pre-S2中存在的T细胞激活表位将有助于提高机体对S抗原的抗体反应水平。因此包含pre-S1及pre-S2的HBV疫苗有助于克服机体对HBV的无应答状态。以HBc作为载体来表达高效疫苗已经受到普遍认可，其作为颗粒样载体具有显著的优越性，可诱导较强的细胞及体液免疫应答。 本研究通过以HBc为载体的HBV preS／S番茄疫苗的研究，探讨HBV转基因番茄作为口服疫苗的可行性，为HBV的预防探讨一条新的途径。先把preS／S基因插入到HBc的第73-94aa处(棘突尖部)，构建了颗粒性表达载体HBc-Hbs；随后将目的基因克隆到植物表达载体pBIN438上，液氮冻融法转化农杆菌eha105；用含pBIN438-HBc-Hbs的根癌农杆菌侵染番茄2／3子叶和下胚轴；在MS_2培养基上培养大约35d，在愈伤组织处可见分化苗；待苗长到3cm时，移到MS_3培养基上，根系发达后，，将完整的植株移栽到土壤中室温生长，共获得67株抗性植株。 CTAB法提取植物总DNA，PCR方法鉴定外源HBc-Hbs基因(1177bp)，34株为阳性。考虑到PCR方法的假阳性，进行了PCR-southern 乙型肝炎病毒(HBV)颗粒性抗原转基因番茄植株的构建及鉴定 blot检测;为进一步证明HBc一Hbs基因的整合情况，将植物总DNA BamHI 酶切过夜;同时设立经相同酶切的重组质粒pB水438一HBc一Hbs为阳性对 照，以非转化植株为阴性对照;根据颗粒性表达载体HBc一Hbs两端序列 设计引物Pl和PZ，以质粒pBIN438一HBc一Hbs为模板，用地高辛标记探 针进行Southem blot杂交分析;通过RT一PCR及Westen blot印迹杂交检 测目的基因在番茄中的转录和翻译情况。PCR、PCR一Southem blot、 Southem blot结果表明目的基因己整合到番茄的基因组中;RT一PCR、 Westem blot的结果证明目的基因已在番茄中转录为mRNA，并成功翻 译成蛋白质，相关的实验还在进行中
【图文】：

(一)目的基因的获得以pcDNA3.1一HBc一Hbs为模板进行PcR扩增，0.8%琼脂糖凝胶电泳分析见图1一1，可见在1177bP左右有一条亮带。ABCDEF2000bP1000帅750bP500bP1177bP200bPIOObP图1一1.目的基因HBc一HbS的获得Figl一1.PCRresultofHBc一HbsLaneA:DNAmarker(DL2000)，LaneB:controlLaneC一F:segme爪5ofHBc一Hbs(二)pGEM.T.RBc一Rbs阳性克隆的筛选纯化上述PCR片段，克隆到pGEM一T载体上，转化DHS。。挑取白斑，PCR方法鉴定阳性克隆，结果见图1一2，可见1170bp处有一亮带。

取阳性克隆抽提质粒，限制性内切酶BamH工和Sal工双酶切，回收目的片段，克隆到植物表达载体pBIN438上，转化DH5a。挑取数十个单克隆，PCR方法鉴定阳性克隆，结果见图1一3。取2个PCR阳性克隆提取质粒，限制性内切酶BamHI和Sal工双酶切，结果见图1一4。
【学位授予单位】：第一军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R392

【引证文献】

相关硕士学位论文 前2条

1 方琳;猪传染性胃肠炎病毒S1基因植物表达载体的构建及转化番茄的研究[D];南京农业大学;2009年

2 郑卿;抗Ⅰ型糖尿病基因转化烟草、番茄的研究[D];扬州大学;2010年

本文编号：2656956