中国对虾肌肉蛋白激发小鼠过敏反应及其机理研究

发布时间：2017-03-25 02:11

  本文关键词：中国对虾肌肉蛋白激发小鼠过敏反应及其机理研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：对虾等水产品食用蛋白的致敏性对食用者的安全健康存在着潜在的威胁,而致敏性的高低主要取决于食用蛋白中过敏原的种类以及含量。对于易过敏人群而言,食用对虾等富含过敏原的食物易引发全身性过敏反应,出现肠道黏膜过敏症状以及体内一些生理指标的变化。鉴于此,本研究拟以具有较高经济价值的特色物种中国对虾为对象,建立腹腔注射该虾肌肉蛋白的ICR小鼠过敏模型,结合间接ELISA测定小鼠血清中过敏原特异性IGE抗体水平以验证过敏模型的成功建立,通过HE/甲苯胺蓝染色以及免疫组化等手段探讨该虾肌肉蛋白引发小鼠肠道黏膜免疫的机理,最后通过测定小鼠相关脏器比重、抗氧化酶活性以及过敏指示酶的变化,表明了机体内发生过敏的过程与一些生理指标变化的相关性。本研究旨在为中国对虾的摄入性过敏及体内相关的免疫调控提供相关理论依据,同时对于临床评估中国对虾过敏原的潜在致敏性具有一定的实际参考意义。主要研究结果如下： 1、采用腹腔免疫中国对虾肌肉蛋白方法,建立针对该虾蛋白过敏的ICR小鼠模型。通过SDS-PAGE电泳和AlphaView SA3.4.0电泳图像分析软件分析,初步推测了中国对虾肌肉蛋白中可能含有的过敏原种类；建立小鼠过敏模型之后,采用间接ELISA方法检测小鼠血清中过敏原特异性IgE水平在激发期不同时间点的变化,并通过各剂量组OD值和对照组OD值的横向比较,结果大多为2.1倍以上,证明该模型已经成功建立,可用于后续实验研究。 2、采用各染色方法及免疫组化方法探讨中国对虾肌肉蛋白引发小鼠肠道黏膜免疫的机理。通过HE染色对小肠肠道形态学观察初步证明了虾蛋白致敏组小鼠肠道发生炎症且导致上皮损伤；对小肠肥大细胞进行甲苯胺蓝染色发现,虾蛋白致敏组小鼠肠道肥大细胞发生了严重的脱颗粒现象,细胞完整率显著降低；免疫组化检测小肠中相关T细胞(CD3+、CD4+、CD8+T细胞)以及IgA+浆细胞的数量,结果显示该虾蛋白致敏个体内小肠内这些细胞阳性率显著高于对照组；提示虾肌肉蛋白引发肠道黏膜免疫反应是通过IgE介导的速发型过敏反应以及T淋巴细胞依赖性延迟型过敏反应协同作用,并伴有B淋巴细胞向IgA+浆细胞持续分化来实现。 3、研究中国对虾肌肉蛋白引发小鼠体内相关脏器比重及酶的变化。采用酶活试剂盒测定抗氧化酶(SOD、POD、CAT、GSH-Px、 GST)和NOS/iNOS活性；使用双抗夹心ELISA方法检测PLA2的浓度；对Ca2+-ATPase mRNA相对表达量的检测采用RT-PCR方法。对各虾蛋白剂量组和对照组小鼠肝脏、肾脏、脾脏比重比较发现,虾蛋白致敏组小鼠肝、肾发生了不同程度的萎缩,且随着注射剂量加大而萎缩程度越严重,而脾脏则发生肿大,且随着注射剂量加大而肿大程度越严重；通过测定小鼠肝、肾、脾及血清中这几种抗氧化酶的活性发现,虾蛋白致敏组个体内这些酶的活性明显升高；而测定小鼠体内肝、肾、脾和/或血清中三种过敏特征酶的变化发现,虾蛋白致敏组个体内肝、肾、脾及血清中NOS/iNOS活性明显提高、PLA2浓度显著增加,而肝脏、肾脏、脾脏内Ca2+-ATPase mRNA相对表达量下降；提示过敏的发生过程与机体内脏器比重、抗氧化酶的活性、NOS/iNOS活性、PLA2浓度以及Ca2+-ATPase mRNA相对表达量均有一定的相关性,这些生理指标可通过与机体内其他相关免疫细胞和细胞因子的相互作用,启动机体内相关的免疫应答。
【关键词】：中国对虾 肌肉蛋白 ICR小鼠 过敏反应 黏膜免疫 酶
【学位授予单位】：浙江工商大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要3-6
• ABSTRACT6-14
• 第一章 文章综述14-32
• 1 食物过敏反应和作用机制14-26
• 1.1 食物过敏和食物过敏原14-17
• 1.1.1 食物过敏14-15
• 1.1.2 食物过敏的流行病学15-16
• 1.1.3 食物过敏原16-17
• 1.2 食物过敏的作用机制17-22
• 1.2.1 食物过敏的一般致敏机制18-19
• 1.2.2 食物过敏的分子致敏机制以及免疫调控19-22
• 1.3 动物模型22-24
• 1.4 食物过敏原的检测技术24-26
• 1.4.1 体内检测技术24
• 1.4.2 体外检测技术24-25
• 1.4.3 食物过敏原检测技术的发展前景25-26
• 2 甲壳类水产过敏原的种类及其研究进展26-30
• 2.1 甲壳类过敏原的种类26-29
• 2.1.1 原肌球蛋白(TM)27
• 2.1.2 精氨酸激酶(AK)27
• 2.1.3 肌球蛋白轻链(MLC)27-28
• 2.1.4 肌钙结合蛋白(SCP)28
• 2.1.5 血蓝蛋白亚基(HCS)28-29
• 2.1.6 磷酸丙糖异构酶蛋白(TPI)29
• 2.2 国外研究进展29-30
• 2.3 国内研究进展30
• 3 本研究的目的、内容和意义30-32
• 3.1 研究的目的及意义30-31
• 3.2 研究的技术路线31-32
• 第二章 中国对虾蛋白制备以及对ICR小鼠过敏模型的建立32-44
• 1 前言32
• 2 实验材料与方法32-40
• 2.1 实验对象32-33
• 2.2 主要试剂33
• 2.3 主要仪器设备33-34
• 2.4 实验方法34-40
• 2.4.1 虾蛋白浸液的制备34-36
• 2.4.1.1 蛋白质提取34
• 2.4.1.2 蛋白含量测定34-36
• 2.4.2 蛋白SDS-PAGE电泳36-38
• 2.4.2.1 相关溶液配置36-37
• 2.4.2.2 SDS-PAGE凝胶配制37
• 2.4.2.3 SDS-PAGE蛋白样品的制备37
• 2.4.2.4 SDS-PAGE电泳步骤37
• 2.4.2.5 染色、脱色37-38
• 2.4.2.6 图像的扫描与分析38
• 2.4.3 虾蛋白ICR小鼠过敏模型的建立38-40
• 2.4.3.1 ICR小鼠分组及喂养38
• 2.4.3.2 免疫方案38
• 2.4.3.3 小鼠血清中特异性IgE的测定38-40
• 3 结果与分析40-42
• 3.1 蛋白的SDS-PAGE分析40
• 3.2 小鼠血清中特异性sIgE的检测结果40-42
• 4 讨论42-43
• 5 本章小结43-44
• 第三章 中国对虾蛋白诱导ICR小鼠肠道黏膜过敏反应的机制研究44-55
• 1 前言44-45
• 2 实验材料与方法45-48
• 2.1 实验对象45
• 2.2 主要试剂45
• 2.3 主要仪器设备45-46
• 2.4 实验方法46-48
• 2.4.1 取材及标本处理46
• 2.4.2 小鼠肠道形态学观察46-47
• 2.4.3 小肠肥大细胞完整率47
• 2.4.4 小鼠小肠绒毛相关T细胞和固有层浆细胞检测47-48
• 3 结果与分析48-52
• 3.1 小鼠肠道的形态学观察48-49
• 3.2 小肠肥大细胞形态学观察以及完整率49-50
• 3.3 小鼠小肠绒毛相关T细胞及固有层IgA~+浆细胞检测50-52
• 3.3.1 小肠绒毛T细胞及固有层浆细胞观察50-52
• 3.3.2 阳性T细胞及IgA~+浆细胞计数和统计学处理52
• 4 讨论52-54
• 5 本章小结54-55
• 第四章 中国对虾蛋白引发ICR小鼠体内脏器比重和相关酶的变化55-72
• 1 前言55-56
• 2 实验材料与方法56-61
• 2.1 实验对象56
• 2.2 主要试剂56
• 2.3 主要仪器设备56-57
• 2.4 实验方法57-61
• 2.4.1 取材及样本处理57
• 2.4.2 小鼠体内不同脏器比重的测定57
• 2.4.3 小鼠体内不同组织及血清中相关抗氧化酶的测定57-58
• 2.4.3.1 组织和血清中SOD、POD、CAT的活性测定57-58
• 2.4.3.2 组织和血清中GSH-Px、GST的活性测定58
• 2.4.4 小鼠体内不同组织及血清中过敏特征酶的测定58-61
• 2.4.4.1 组织和血清中NOS/iNOS的活性测定58
• 2.4.4.2 组织和血清中PLA_2的浓度测定58-59
• 2.4.4.3 组织中Ca~(2+)-ATPase相对表达量测定59-61
• 3 结果与分析61-69
• 3.1 小鼠体内不同组织的脏器指数比较61-62
• 3.2 小鼠体内不同组织及血清中相关抗氧化酶的活性变化62-65
• 3.2.1 组织和血清中SOD、POD、CAT的活性变化62-64
• 3.2.2 组织和血清中GSH-Px、GST的活性变化64-65
• 3.3 小鼠体内不同组织和血清中过敏特征酶变化65-69
• 3.3.1 组织和血清中NOS/iNOS的活性变化65-66
• 3.3.2 组织和血清中PLA_2的浓度变化66-67
• 3.3.3 组织中Ca~(2+)-ATPase相对表达量变化67-69
• 4 讨论69-70
• 5 本章小结70-72
• 第五章 总结论、创新点及研究展望72-75
• 1 总结论72-73
• 2 创新点73
• 3 研究展望73-75
• 参考文献75-83
• 附录 缩略词中英文对照表83-85
• 硕士期间完成的论文85-86
• 致谢86-87

【参考文献】

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本文编号：266513