假结核耶尔森氏菌中rpoS基因的功能研究

发布时间：2017-03-25 12:06

  本文关键词：假结核耶尔森氏菌中rpoS基因的功能研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：RpoS,又叫σS因子,是rpoS基因的编码产物。RpoS作为稳定期的σ因子和压力应答过程中的主要调节因子,能够调控细菌体内大量基因的表达,并且这些基因主要是与抗环境胁迫相关的基因。然而,在不同细菌中RpoS的功能似乎存在一定差别。例如,在大肠杆菌(Escherichia coli)中,RpoS对于细菌鞭毛的形成具有重要的调节作用。而在迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)中,RpoS对生物膜的形成具有一定的影响。在抵御外界环境胁迫的过程中,细菌VI型分泌系统、鞭毛及生物膜等可作为细菌的压力应答机制,对细菌起到保护作用。且有报道指出,生物膜是导致病原菌突破宿主细胞防御机制并引发感染的重要原因。本研究中假结核耶尔森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis)属于耶尔森氏菌属,是一种革兰氏阴性肠道致病菌,为人畜共患菌种。作为一种病原菌,其首先要克服的就是宿主细胞的防御机制,之后才能发挥致病功能。然而目前为止,假结核耶尔森氏菌的致病机制尚未完全阐明。基于以上研究背景,本研究构建了rpoS基因突变株及互补菌株,检测了假结核耶尔森氏菌中rpoS基因的生理功能,包括在多种环境胁迫中的作用,对T6SS表达的调控,对鞭毛的调节作用以及对生物膜形成的影响。研究结果显示,在细菌对环境的适应方面,RpoS具有重要的调节作用。具体结果为:(1)通过构建假结核耶尔森氏菌rpoS基因突变株与互补菌株,研究在1.5mM H2O2、pH4.0、0.5M NaCl和42℃胁迫条件下RpoS的功能。发现在这四种胁迫条件下,rpoS基因突变株的存活率较野生型菌株明显降低。说明在假结核耶尔森氏菌中,RpoS在抵抗多种环境压力中均具有重要的作用。(2)利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)手段检测rpoS基因突变体中9种已知的压力应答相关基因的转录水平,结果显示,除gadA基因外,其余8种基因的转录均受到RpoS的正调节。该结果进一步说明RpoS可能是通过调节细胞内一些压力应答相关基因的表达而在细菌抗胁迫中发挥功能的。(3)通过β-半乳糖苷酶活性测定实验,发现在rpoS基因突变体中第四套VI型分泌系统(T6SS4)的启动子活性明显降低。且qRT-PCR结果显示,rpoS基因缺失将导致T6SS4的关键组分clpV4,hcp4,vgrG4基因的转录水平降低。凝胶迁移阻滞实验结果进一步证实,RpoS对于T6SS4的调控是直接的。(4)对细菌的泳动情况进行观察发现,RpoS对细菌的运动具有正调节作用,并且β-半乳糖苷酶活性测定结果进一步说明RpoS能够激活鞭毛一级调控基因flhDC的表达。(5)对线虫体表生物膜形成的情况进行统计分析,结果显示RpoS对于生物膜的形成具有正调节作用。(6)通过对胞外多糖含量的测定及对多糖合成基因hmsHFRS的启动子活性进行测定发现,RpoS能够控制胞外多糖的合成,进而影响假结核耶尔森氏菌生物膜的形成。
【关键词】：假结核耶尔森氏菌 rpoS基因 细菌VI型分泌系统 生物膜 鞭毛
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R378
【目录】：

• 中文摘要5-7
• abstract7-12
• 第一章 文献综述12-23
• 1.1 rpoS基因概述12-15
• 1.1.1 RNA聚合酶 σ 因子简介12
• 1.1.2 σS（RpoS）的表达调控12-13
• 1.1.3 σS（RpoS）识别的启动子序列13-14
• 1.1.4 rpoS基因的功能14-15
• 1.2 细菌VI型分泌系统概述15-17
• 1.2.1 细菌分泌系统简介15-16
• 1.2.2 细菌VI型分泌系统的结构16-17
• 1.2.3 细菌VI型分泌系统的功能17
• 1.3 细菌的鞭毛系统17-19
• 1.3.1 鞭毛的结构17-18
• 1.3.2 鞭毛的功能18-19
• 1.3.3 鞭毛基因的表达调控19
• 1.4 细菌生物膜简介19-21
• 1.4.1 生物膜的形成机制与组成成分20-21
• 1.4.2 生物膜的调控机制21
• 1.5 假结核耶尔森氏菌概述21-22
• 1.6 本研究目的意义22-23
• 第二章 材料与方法23-31
• 2.1 材料23
• 2.1.1 菌株和质粒23
• 2.1.2 试验试剂和培养基23
• 2.2 方法23-31
• 2.2.1 原核表达质粒pET28a-rpoS和互补质粒pKT100-rpoS的构建23-25
• 2.2.2 突变体的制备25
• 2.2.3 氯化铷法制备感受态25-26
• 2.2.4 细菌生长曲线的测定26
• 2.2.5 细菌存活率的测定26
• 2.2.6 重组蛋白原核表达和纯化26-27
• 2.2.7 lacZ报告基因的融合及 β-半乳糖苷酶活性测定27
• 2.2.8 凝胶迁移阻滞实验（EMSA）27-28
• 2.2.9 实时荧光定量PCR检测胁迫相关基因的表达28-29
• 2.2.10细菌运动性的检测29
• 2.2.11生物膜形成能力的检测29
• 2.2.12胞外多糖的定量测定29-31
• 第三章 试验结果31-43
• 3.1 △rpoS突变体的构建31-33
• 3.1.1 敲除质粒的构建原理31
• 3.1.2 重组质粒pDM4-△rpoS的构建31-32
• 3.1.3 rpoS基因突变体的筛选32-33
• 3.2 RpoS对细菌生长状态的影响33
• 3.3 假结核耶尔森氏菌中RpoS抗胁迫功能的研究33-36
• 3.3.1 RpoS抗氧化胁迫功能的研究34
• 3.3.2 RpoS抗酸胁迫功能的研究34-35
• 3.3.3 RpoS抗渗透压胁迫功能的检测35
• 3.3.4 RpoS抗热胁迫功能的研究35-36
• 3.4 RpoS对胁迫相关基因的调节作用36
• 3.5 RpoS对VI型分泌系统的调控作用36-39
• 3.5.1 RpoS对T6SS4的调节作用36-37
• 3.5.2 RpoS与T6SS4启动子结合的检测37-39
• 3.6 rpoS基因与细菌运动性的关系39
• 3.7 rpoS基因在生物膜形成方面的作用39-43
• 3.7.1 线虫表面生物膜形成情况的观察39-40
• 3.7.2 生物膜形成严重程度的统计40-41
• 3.7.3 RpoS对胞外多糖合成的影响41-43
• 第四章 分析与讨论43-45
• 第五章 结论45-46
• 参考文献46-52
• 附录52-56
• 致谢56-57
• 作者简介57

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 王淑娴;魏鉴腾;李天保;杨秀生;;细菌中RpoS蛋白的表达调控及其功能的研究进展[J];生物技术通报;2011年10期

  本文关键词：假结核耶尔森氏菌中rpoS基因的功能研究，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：267167