人表皮生长因子基因真核表达载体构建及基因转染

发布时间：2020-05-25 23:01

【摘要】：表皮生长因子(EGF)属于促生长因子家族成员之一,是表皮细胞、上皮细胞和间充质等敏感细胞的丝裂原,为最有力的促细胞增殖分化的细胞因子之一。现已证明,人表皮生长因子(hEGF)可刺激外胚层和内胚层来源的一些组织有丝分裂和刺激合成作用,可加速皮肤、角膜上皮、胃肠道粘膜上皮的损伤修复。 目前EGF重组蛋白已试用于促外科手术伤口及创面愈合、促角膜创伤的愈合及促胃肠道溃疡的研究,部分已进入临床应用。但由于hEGF重组蛋白为小分子蛋白质,半衰期短,在体内易降解,如采用合适的载体将hEGF基因导入体内或将转染hEGF基因的靶细胞植入损伤局部,使其在损伤部位持续分泌表皮生长因子,必将有利于创面的愈合。 本研究利用基因工程技术克隆了人表皮生长因子结构基因,并完成真核表达载体的构建。在脂质体的协助下将pcDNA3.1-hEGF导入角膜组织细胞中,表达hEGF重组蛋白,为hEGF基因治疗组织损伤奠定了基础。 实验方法 1.hEGF基因克隆提取富含hEGF组织中的总RNA,经RT-PCR获得hEGF基因,克隆到载体PGEM-TEasy中,使hEGF扩增,筛选鉴定重组体。 2.hEGF基因真核表达载体构建及序列分析通过设计合适的酶切位点,将hEGF基因定向克隆到真核表达载体pcDNA3.1中,完成hEGF真核表达载体构建。用生物学软件对hEGF基因序列测定及分析。 3.hEGF基因转染阳离子脂质体Lipofectin与pcDNA3.1-hEGF重组质粒以适当比例 郑州大学2004届硕士研究生毕业论文 人表皮生长因子基因真核表达载体构建及基因转染 混合,转染角膜组织,分别从DNA、RNA、蛋白质三个水平上检测EGF基因表达情况。 结果 1.hEGF基因克隆RT一PCR扩增可从胎儿领下腺、成人腮腺获得hEGF基因片段,长度 为162bp,胎儿领下腺中hEGF基因与克隆载体PGEM一TEasy连接,完成hEGF基因克隆, 经蓝白筛选、酶切及PCR鉴定重组体,获得阳性克隆。 2.hEGF基因真核表达载体构建及序列分析经Hindlll、Ba栩I酶切PGEM一TEasy一hEGF, 将hEGF基因定向克隆到真核表达载体pcDNA3.1中。序列分析结果表明,pcDNA3.1一hEGF 基因序列与Genbank hEGF序列相比,二者碱基同源性达98.2%,为相同的氨基酸编码。 3.hEGF基因转染PCR、RT一PCR在转染后21天之内,在DNA、RNA水平上可检测到hEGF 基因;免疫组织化学检测法最早在转染后24h可检测到hEGF基因表达,在转染后2周 之内均可以检测到hEGF表达,而2周之后,表达结果为阴性。 结论 1.不同组织中hEGF含量不同,胎儿领下腺较高,与hEGF促胚胎发育作用有关; 2.完成了hEGF克隆载体的构建; 3.完成了hEGF基因真核表达载体构建; 4.hEGF基因序列与Genbank上公布的序列相比,碱基同源性达98.2%,氨基酸完全相 同; 5.pCDNA3.1一hEGF重组质粒与Lipofectin以适当比例混合形成的微囊可携带hEGF基 因进入细胞内并表达功能蛋白。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R346

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本文编号：2680870