HCMV皮层蛋白pUL76非保守C端与染色体损伤的研究

发布时间：2017-03-26 03:10

  本文关键词：HCMV皮层蛋白pUL76非保守C端与染色体损伤的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:本研究通过构建人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)皮层蛋白pUL76的保守N端和非保守C端的真核表达载体,转染至真核细胞,确定pUL76引起染色体损伤的决定序列。方法:通过PCR方法获取HCMV AD169株UL76基因的全长,保守N端和非保守的C端的编码序列并在扩增产物的两端分别加上BamHI和HindⅢ限制性酶切位点,然后构建至绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-N1。构建的重组质粒分别命名为pEGFP-UL76,pEGFP-UL76N,pEGFP-UL76C。将构建的质粒通过双酶切和测序验证后分别转染HEK293细胞和HF细胞,IFA检测不同转染组染色体损伤信号γ-H2AX与绿色荧光蛋白的共定位情况,WB检测不同转染组染色体损伤信号γ-H2AX的相对表达量。彗星实验检测不同转染组细胞染色体损伤状况。结果:1.双酶切和测序结果显示pUL76全长、保守N端和非保守的C端编码序列均正确克隆至真核表达载体pEGFP-N1,用EGFP抗体做WB显示各片段均正确表达。2.单独转染pUL76全长或非保守C端,IFA结果显示γ-H2AX与EGFP融合蛋白共定位,且WB结果显示γ-H2AX相对表达量较转染空载体(pEGFP-N1)对照组上升差异有显著性。单独转染pUL76保守N端,γ-H2AX与EGFP融合蛋白不出现共定位现象,WB结果显示γ-H2AX相对表达量较转染空载体(pEGFP-N1)对照组上升差异没有显著性。3.单独转染pUL76全长或非保守C端,彗星实验显示出现染色体损伤的细胞比例明显上升,而单独转染pUL76保守N端,出现染色体损伤的细胞比例变化较对照组无明显差异。4.单独转染pUL76全长或非保守C端细胞内荧光信号主要集中在核内,且绿色荧光信号聚集成斑块样;而单独转染空载体或pUL76保守N端细胞内荧光信号均匀分布整个细胞,不出现聚集现象。结论:UL76非保守C端是引起染色体损伤的决定区域。
【关键词】：人巨细胞病毒 皮层蛋白 UL76 染色体损伤
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R373
【目录】：

• 缩略词表5-6
• 中文摘要6-7
• 英文摘要7-9
• 前言9-17
• 材料方法17-24
• 结果24-35
• 讨论35-38
• 结论38-39
• 参考文献39-42
• 附录一:个人简历42-43
• 附录二:致谢43-44
• 综述44-52
• 参考文献49-52

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本文编号：268185