人源抗TLR4抗体Fab片段抑制内毒素（LPS）引起的炎症反应的体内及体外研究

发布时间：2017-03-26 09:05

  本文关键词：人源抗TLR4抗体Fab片段抑制内毒素（LPS）引起的炎症反应的体内及体外研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：Toll样受体4(TLR4)是Toll受体家族中发现最早并研究最深的模式识别受体,在先天免疫中扮演重要的角色。TLR4主要识别内毒素(LPS),激活其信号通路,引起急性炎症、败血症、慢性感染性疾病等。TLR4是内毒素发挥生物学效应的瓶颈和内毒素瀑布效应的限速步骤,是整个内毒素信号转导通路的枢纽,阻断TLR4对内毒素信号的传导,是控制内毒素生物效应的最为有效的手段。因此,研究与开发治疗性抗TLR4基因工程抗体,应用于G-细菌感染性疾病和感染性休克的治疗,有望能够迅速阻断病情发展、挽救患者的生命。在我们前期研究中,利用嵌合抗体技术,针对人源抗TLR4抗体设计合成抗TLR4抗体Fab片段,利用重叠延伸法扩增Fab片段基因,成功的构建了质粒,表达出抗TLR4抗体Fab片段,并命名为h TLR4-Fab04。在本研究中,我们主要通过建立细不同种系细胞及动物炎症模型,在体内外验证抗TLR4抗体Fab片段对LPS引起的炎症反应的抑制情况。研究方法1.分析h TLR4-Fab04是否结合小鼠巨噬细胞表面TLR4分子,探讨h TLR4-Fab04阻断LPS引起的TLR4信号通路活化后,Q-PCR和ELISA检测相关炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1和IFN-β在m RNA和蛋白水平的表达改变情况,观察TLR4相关信号通路MAPKs、NF-κB和IRF-3等的磷酸化水平改变情况。2.分析h TLR4-Fab04是否结合小鼠树突状细胞表面TLR4分子,探讨h TLR4-Fab04阻断LPS引起的TLR4信号通路活化后,Q-PCR和ELISA检测相关炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1和IFN-β在m RNA和蛋白水平的表达改变情况,观察TLR4相关信号通路MAPKs、NF-κB和IRF-3等的磷酸化水平改变情况。3.分析h TLR4-Fab04是否结合人外周血PBMC来源的巨噬细胞表面TLR4分子,探讨h TLR4-Fab04阻断LPS引起的TLR4信号通路活化后,Q-PCR和ELISA检测相关炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1和IFN-β在m RNA和蛋白水平的表达改变情况,观察TLR4相关信号通路MAPKs、NF-κB和IRF-3等的磷酸化水平改变情况。4.分析h TLR4-Fab04是否结合人外周血PBMC来源的树突状细胞表面TLR4分子,探讨h TLR4-Fab04阻断LPS引起的TLR4信号通路活化后,Q-PCR和ELISA检测相关炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1和IFN-β在m RNA和蛋白水平的表达改变情况,观察TLR4相关信号通路MAPKs、NF-κB和IRF-3等的磷酸化水平改变情况。5.利用小鼠内毒素休克模型观察h TLR4-Fab04在体内炎症反应的抑制情况。将h TLR4-Fab04和对照抗体腹腔注射C57BL/6J小鼠,观察h TLR4-Fab04对内毒素休克小鼠血清细胞因子的变化情况。研究结果1.h TLR4-Fab04与人外周血来源的巨噬细胞及DCs表面TLR4分子结合率高达90%,与鼠源巨噬细胞及DCs表面TLR4分子结合率达到60%左右。2.在LPS诱导的四种细胞炎症模型中,h TLR4-Fab04均可从m RNA水平和蛋白水平抑制炎症因子(TNF-α、IL-6、IL-1和IFN-β)的表达。抑制效率都可以达到50%左右。3.在LPS诱导的四种细胞炎症模型中,h TLR4-Fab04对TLR4信号通路下游的MAPKs(JNK、ERK、p38)、NF-κB(IKK、IκB、p65)和IRF-3磷酸化水平均有不同程度的抑制。4.在动物细胞模型中,不同浓度的hTLR4-Fab04均显示出对小鼠血清中炎症因子(TNF-α、IL-6、IL-1和IFN-β)有一定的抑制效果,当h TLR4-Fab04浓度为2mg/kg时,对四种炎症因子抑制效率最佳,抑制率均可达50%左右。结论本研究验证了h TLR4-Fab04可以与不同来源的细胞表面TLR4分子结合。在体外和体内实验中,h TLR4-Fab04均显示出对内毒素(LPS)引起的炎症反应有抑制效果。本研究为h TLR4-FTLR4在临床实验中提供了实验基础。同时,也为治疗SIRS等内毒素感染引起的疾病提供了一种新的方法。
【关键词】：Toll样受体4 内毒素 hTLR4-Fab04 炎症反应 炎症因子 TLR4信号通路
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R392
【目录】：

• 英文缩略词汇表6-8
• 中文摘要8-11
• Abstract11-14
• 1. 前言14-18
• 2. 实验材料18-23
• 2.1 主要试剂与材料18-21
• 2.2 主要仪器21
• 2.3 常用溶液配制21-23
• 3. 实验方法23-30
• 3.1 细胞分离与培养23-25
• 3.2 体外实验25-28
• 3.3 体内实验28-30
• 4. 实验结果30-46
• 4.1 h TLR4-Fab04 可与不同种系细胞表面TLR4 分子结合30-32
• 4.2 h TLR4-Fab04 抑制炎症因子m RNA水平的表达32-36
• 4.3 h TLR4-Fab04 抑制炎症因子蛋白水平的表达36-40
• 4.4 h TLR4-Fab04 抑制TLR4 信号通路磷酸化水平40-44
• 4.5 h TLR4-Fab04 抑制小鼠血清中炎症因子释放44-46
• 5. 讨论46-49
• 6. 结论49-50
• 7. 参考文献50-54
• 8. 附录综述54-64
• 参考文献60-64
• 本人简历64-65
• 研究成果65-66
• 致谢66

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