昆明种小鼠胚胎干细胞的分离及体外培养

发布时间：2020-05-30 12:10

【摘要】：目的: 本实验旨在研究如何从昆明种小鼠的囊胚中分离出具有发育全能性 的胚胎干细胞,并分析其部分生物学特性。 方法:采用整胚培养法,通过将超排卵后孕 3.5 天的昆明种小鼠囊胚与由孕 13.5 天的小鼠胚胎制备的胚胎成纤维细胞饲养层共培养,以高糖 DMEM 添加 15%胎牛血清、2mmol/lL-谷氨酰胺、0.1mmol/lβ—巯基乙醇,以及 1000u/ml 的 鼠白血病抑制因子(mLIF)和青霉素钠、链霉素等为培养基,利用自制的玻璃 微针在解剖显微镜下机械分离增殖 2~3 天的内细胞群(ICM),在 0.25%胰蛋白 酶—0.04%EDTA 混合消化液的液滴中消化 3~5min,然后再接种到新的饲养层上 培养。观察记录消化后细胞集落的生长情况,对 ES 细胞样集落继续消化传代培 养,并行钙-钴法的碱性磷酸酶染色(AKP)检测。同时将同一天冲出的囊胚, 分成 7 盘接种在同一批制备的饲养层上(每盘 5 个囊胚),待其长出 ICM 后,连 续每天检测 ICM 的 AKP 染色情况。观察 ICM 的细胞在培养过程中的 AKP 活性 变化。 结果:获得胚胎干细胞集落,并在后期培养中能分化成具有自动节律性收缩 的心肌细胞。经碱性磷酸酶(AKP)染色检测,发现昆明种小鼠囊胚的内细胞群 细胞(ICM)和由其分离的 ES 细胞集落均显示 AKP 强阳性,说明它们具有发育 全能性,具备干细胞的特征。同时用 AKP 染色检测不同时间段生长的 ICM,发 现增殖 2~5 日龄的 ICM 有较强的 AKP 表达,而 7 日龄的 ICM 则开始分化,检 测结果为阴性。 结论:①增殖 5 日龄前的 ICM 可用于分离 ES 细胞,7 日龄的 ICM 已经分 化不能用于分离 ES 细胞②可以从昆明种小鼠囊胚的内细胞群中分离出具有发育 全能性的 ES 细胞③ES 细胞在一定条件下可以被诱导分化为能自发跳动的心肌 细胞。
【图文】：

19.20所示):为强阳性，，而饲葬层的鼠胚成纤维细胞则不着色

桑椎胚txlOn)孕3.5夭的小鼠胚胎小部分是桑徽胚，图中可见其外包完整的透明带，透明带下方有10多个由受釉卵卵裂形成的卵裂球
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R329

【参考文献】

相关期刊论文 前3条

1 尚克刚,胡新立;小鼠囊胚的不同遗传背景对形成ES细胞集落的影响[J];北京大学学报(自然科学版);1993年02期

2 孟国良,滕路,薛友纺,尚克刚;BALB/c小鼠胚胎干细胞系建立的方法学探讨[J];遗传学报;2002年07期

3 刘兰英,杨琨,朱振宇,刘玉川,余细勇,银巍,汤建,马涧泉,顾军;胚胎干细胞体外分化为心肌细胞诱导因素的探讨[J];中国病理生理杂志;2000年05期

本文编号：2688111