TLR3、TLR7受体在呼吸道合胞病毒感染A549细胞诱导Ⅰ型干扰素中的作用研究

发布时间：2017-03-26 13:03

  本文关键词：TLR3、TLR7受体在呼吸道合胞病毒感染A549细胞诱导Ⅰ型干扰素中的作用研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:探讨呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)感染人肺泡Ⅱ型上皮细胞(A549)后,Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)3、7的水平变化,初步研究TLR3和TLR7活化后在RSV感染中介导产生的I型干扰素(interferon,IFN)抗病毒作用及其可能的调控机制,为临床预防与治疗RSV的感染提供新的思路。方法:以RSV感染A549细胞后,分为正常对照组、RSV感染组、TLR3小干扰RNA(TLR3 si RNA)沉默组、TLR7小干扰RNA(TLR7 si RNA)沉默组。分别于感染的4h、8h、12h和24 h后收集各组细胞以及上清液,以未感染病毒的细胞组为正常对照组。(1)用Trizol试剂提取细胞总RNA,半定量RT-PCR法检测各组TLR3、TLR7、干扰素调节因子3(Interferon regulatory factor 3,IRF3)、干扰素调节因子7(IRF7)、干扰素α(IFN-α)、干扰素β(IFN-β)的m RNA表达量变化;(2)免疫印迹法(Western-blot)检测RSV感染A549细胞各组在4h、8h、12h和24 h的TLR3、TLR7蛋白水平的变化。(3)酶联免疫吸附法(ELISA)检测感染不同时间点细胞培养上清中IFN-α、IFN-β、TNF-α、IL-1β含量的变化。(4)空斑形成实验(plaque forming unit,PFU)测定感染A549细胞的RSV病毒滴度以及各组病毒增殖情况。结果:①在m RNA转录水平,感染组上调TLR3/7、IRF3/7、IFN-α/β的m RNA基因表达;在两沉默组,TLR3/7、IRF3/7、IFN-α/β的m RNA较感染组相同时间点的表达量明显减少,减少有统计学差异;TLR3 si RNA沉默组,IFN-β下降较IFN-α更为显著,而在TLR7 si RNA沉默组,IFN-α下降较IFN-β更为显著。②在蛋白表达水平,RSV感染组上调TLR3、TLR7蛋白的表达;在两沉默组,TLR3和TLR7蛋白量比感染组相同时间点的表达量减少;且在TLR3 si RNA沉默组,TLR3蛋白量下降较TLR7更明显,TLR7 si RNA沉默组,TLR7的蛋白表达量较TLR3蛋白量下降更明显;③RSV感染A549细胞后,明显上调细胞培养上清中IFN-α/β和炎性因子TNF-α、IL-1β的分泌量,两沉默组IFN-α/β的量均下降,炎性因子的量升高,在TLR3 si RNA沉默组IFN-β较IFN-α下降的更明显,炎性因子升高的更明显;TLR7 si RNA沉默组IFN-α的量下降的更明显。④RSV感染组,病毒增殖滴度随时间的延长而上调;两沉默组的病毒增殖滴度都较感染组高,且TLR3 si RNA沉默组较TLR7 si RNA沉默组病毒增殖滴度更高。结论:本实验证明,RSV感染A549细胞后,TLR3及TLR7被活化能够抵抗呼吸道合胞病毒感染,分别通过IRF3和IRF7途径诱导产生I型干扰素,发挥了抗病毒免疫;而抗病毒免疫反应中TLR3途径可能更占主导地位;且由TLR3诱导产生的最主要I型干扰素是IFN-β,由TLR7诱导产生的最主要I型干扰素是IFN-α。
【关键词】：呼吸道合胞病毒 Toll样受体 I型干扰素 TLR3/7 siRNA A549细胞
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R373
【目录】：

• 英文缩略词6-8
• 中文摘要8-10
• 英文摘要10-12
• 1. 前言12-14
• 2. 材料与方法14-28
• 2.1 材料14-15
• 2.1.1 病毒和细胞14
• 2.1.2 试剂购置14
• 2.1.3 仪器和设备14-15
• 2.2 方法15-27
• 2.2.1 配制溶液15-17
• 2.2.2 RSV增殖及感染单位量测定17-18
• 2.2.3 细胞培养与病毒接种18
• 2.2.4 siRNA转染A549细胞与检测细胞转染效率18-19
• 2.2.5 实验分组19
• 2.2.6 TLR3,TLR7, IRF3, IRF7, IFN-α, IFN-β 在RSV感染组和siRNA沉默组的mRNA转录水平检测19-22
• 2.2.6.1 A549细胞中总RNA提取20
• 2.2.6.2 RNA定性与定量分析20
• 2.2.6.3 两步RT-PCR方法检测20-22
• 2.2.6.4 琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果22
• 2.2.7 A549细胞TLR3,TLR7蛋白的Western blot检测22-26
• 2.2.7.1 总蛋白样本的制备22
• 2.2.7.2 Lowry法蛋白定量22-24
• 2.2.7.3 蛋白免疫印迹法检测TLR3,TLR7的蛋白表达24-26
• 2.2.8 E L I S A法 检测A 54 9 细胞培养上清中的IFN-α,IFN-β,TNF-α,IL-1β 含量26-27
• 2.3 统计学分析27-28
• 3. 结果28-45
• 3.1 病毒PFU检测28
• 3.2 转染效率的检测和 siRNA 转染细胞后 mRNA 表达情况28-29
• 3.3 检测RSV感染组和siRNA沉默组中TLR3、TLR7，IRF3，IRF7，，IFN-α，IFN-β的m RNA转录水平29-37
• 3.3.1 TLR3 mRNA在各组不同时间点的表达29-31
• 3.3.2 TLR7 mRNA在各组不同时间点的表达31-32
• 3.3.3 IRF3 mRNA在各组不同时间点的表达32-33
• 3.3.4 IRF7 mRNA在各组不同时间点的表达33-35
• 3.3.5 IFN-α mRNA在各组不同时间点的表达35-36
• 3.3.6 IFN-β mRNA在各组不同时间点的表达36-37
• 3.4 TLR3,TLR7蛋白在各组不同时间点蛋白的水平变化37-39
• 3.4.1 TLR3在各组不同时间点的蛋白水平变化37-38
• 3.4.2 TLR7在各组不同时间点的蛋白水平变化38-39
• 3.5 ELISA检测A549细胞培养上清液IFN-α,IFN-β,TNF-α,IL-1β 的变化39-43
• 3.6 空斑形成实验（PFU）检测各组细胞培养上清病毒滴度43-45
• 4. 讨论45-48
• 5. 结论48
• 参考文献48-53
• 附录 个人简历53-54
• 致谢54-55
• 综述55-62
• 参考文献60-62

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本文编号：268822