乙型肝炎病毒逆转录酶区rtI233V变异的演变及病毒学特点分析

发布时间：2017-03-27 15:00

  本文关键词：乙型肝炎病毒逆转录酶区rtI233V变异的演变及病毒学特点分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的分析乙肝病毒(hepatitis B virus,HBV)逆转录酶区rtI233V变异的演变规律及其与阿德福韦酯(ADV)耐药的相关性。方法分析了9830例慢性HBV感染者血清样本中HBV rtI233V变异的检出率。选择其中2例代表性患者的动态收集血清样本,扩增HBV RT基因并克隆测序(20个克隆/样本)以观察rtI233V变异的演变过程。构建pTriEx-HBV1.1倍野生株(WT)、3种临床变异株(rtI233V、rtN236T、rtI233V+rtN236T)和定点回复突变株(rtN236T)复制子,瞬时转染入HepG2肝癌细胞,分别加入不同浓度梯度或最高浓度的拉米夫定(LAM)、阿德福韦酯(ADV)、恩替卡韦(ETV)和替诺福韦(TDF)作用,采用实时荧光定量PCR法检测不同药物浓度作用后细胞培养上清中HBV DNA水平,分析变异病毒复制力与表型耐药变化特点。结果9830例慢乙肝患者血清样本中共检出rtI233V位点变异28例,检出率为0.28%,其中rtI233V单独变异19例,与rtN236T等经典耐药变异联合出现9例。该变异的检出患者均有ADV治疗史,其中16例(57.1%)接受ADV单药治疗6个月以上,12例(42.9%)接受包括ADV的多药序贯联合治疗1年以上。患者1相对病毒复制力与表型耐药分析显示,rtI233V变异株的复制力与野生株接近(98.2%),rtN236T变异株则较野生株显著降低(55.4%);rtI233V+rtN236T变异株的相对病毒复制力为野生株的100.4%,表明rtI233V变异可明显恢复rtN236T变异株受损的复制力;rtN236T、rtI233V+rtN236T和rtI233V变异株对ADV的敏感性分别为野生株的1/6.82,1/5.28和1/1.57,rtN236T和rtI233V+rtN236T变异株对ADV耐药,而rtI233V变异株对ADV仍然敏感,与rtN236T联合变异对ADV耐药性的影响不大。患者2:rtI233V变异株的相对病毒复制力为野生株的102.5%;对ADV的敏感性为野生株的1/0.76。rt I233V变异株对ADV及LAM、ETV和TDF均敏感。ADV对临床变异株rtI233V+rtN236T和定点回复突变株rtN236T(lab)的抑制率相似,进一步证实rtI233V变异株对ADV耐药性影响不大。结论rtI233V位点变异与ADV应答不佳相关,但不直接降低病毒对ADV的敏感程度,可以恢复经典ADV耐药病毒株的复制力,是一种复制力补偿变异。
【关键词】：乙型肝炎病毒 阿德福韦酯 基因变异 复制力 耐药性
【学位授予单位】：桂林医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R373.21
【目录】：

• 中文摘要5-7
• ABSTRACT7-10
• 英汉缩略词对照表10-12
• 前言12-13
• 1 对象与方法13-33
• 1.1 研究对象13
• 1.2 实验主要仪器13
• 1.3 主要试剂13-14
• 1.4 实验方法14-15
• 1.5 HBV DNA巢式PCR扩增15-17
• 1.6 PCR扩增产物的检测17
• 1.7 HBV DNA的克隆及测序分析17-22
• 1.8 定点突变22-24
• 1.9 pTriEx-HBV(C) 1.1 倍重组载体的构建及鉴定24-28
• 1.10 转染级质粒的提取及浓度的测定28-30
• 1.11 分板、转染30-32
• 1.12 重组载体质粒转染HepG2细胞并加药培养32
• 1.13 统计学处理32-33
• 2 结果33-43
• 2.1 临床样本资料和r t I 23 3 V变异检出分析33
• 2.2 例典型CHB患者PCR扩增产物33-34
• 2.3 扩增产物HBV RT区TA克隆测序及其基因型分析34-37
• 2.4 定点突变结果37-38
• 2.5 重组载体质粒酶切鉴定及测序鉴定38-39
• 2.6 各变异病毒株复制力水平及其表型耐药特点分析39-43
• 3 讨论43-47
• 4 结论47-49
• 参考文献49-54
• 综述 乙型肝炎病毒阿德福韦酯耐药相关变异的研究进展54-71
• 参考文献65-71
• 攻读学位期间发表的学术论文目录71-72
• 致谢72-74

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