体外诱导人脐带血干细胞向肝细胞样细胞分化的研究

发布时间：2020-06-12 00:11

【摘要】：背景与目的干细胞是一类具有自我复制和增殖分化能力的原始细胞，是形成生命机体各种组织器官的起源细胞。根据其发育阶段，干细胞可分为胚胎干细胞(Embryonic stemcells)和成体干细胞(Adult stem cells)。胚胎干细胞由于伦理、法律等原因研究和应用受限，因此人们更加关注成体干细胞的研究。成体干细胞的可塑性是目前研究的热点领域，特定的组织干／祖细胞具有多向分化潜能，不仅可以分化为同一胚层来源的细胞，而且可以跨胚层“横向分化”(Trans—Differentiation)为不同胚层来源的细胞。1999年美国科学家发现小鼠肌肉组织干细胞可以横向分化成血液细胞，之后研究者又证实从胎儿脑组织中获得的神经干细胞能产生血液细胞，造血干细胞和间充质干细胞能产生骨骼肌、心肌、肝细胞、神经胶质细胞和神经元样细胞。研究证明，脐带血中富含造血干／祖细胞，是骨髓和外周血后的第三种造血干细胞来源。并且脐带血中的造血干细胞的增殖能力与自我更新能力超过或相似于骨髓中的造血干细胞。而且随着研究的深入，发现脐带血中不但含有丰富的造血干细胞，还含有多潜能干细胞，也称为间充质干细胞，可向内皮、血管以及神经等组织分化。干细胞在生物医学领域研究取得的成就，为肝脏疾病的治疗研究提供了新的思路。成体干细胞的定向诱导分化可向肝细胞移植、生物人工肝提供充足的供体，以期用来治疗各种急、慢性肝功能衰竭和肝脏代谢性疾病。目前对体内外诱导骨髓干细胞向肝细胞分化已有较多研究，但体外诱导脐带血干细胞定向分化为肝细胞则少见报道。基于目前的研究现状，本课题旨在探明人脐带血单个核细胞和间充质干细胞能否在体外诱导分化为肝细胞样细胞，并探索脐带血干细胞诱导分化为肝细胞样细胞的分化条件。另外通过观察两种生长因子的作用及其相应受体的表达情况，探讨这些因素在脐带血干细胞向肝细胞定向分化中的作用，从而在一定程度上探讨分化的机制。郑州大学2004年硕士体外诱导人脐带血干细胞向肝细胞样细胞分化的研究方法无菌条件下穿刺脐静脉，密闭式采血法采集正常产妇(妊娠36一42周)脐带血，构椽酸盐、磷酸盐和葡萄糖(CPD)抗凝，用相对密度为1.077的淋巴细胞分离液分离脐带血单个核细胞，台盼蓝染色和苏木素染核判定细胞活度及纯度，进而采用贴壁培养法获得间充质干细胞，单个核细胞和间充质干细胞用含1既胎牛血清的DMEM (高糖)进行纯化和扩增培养，，用流式细胞仪检测其表面标志。对单个核细胞和间充质干细胞分别用肝细胞生长因子(HGF)、成纤维细胞生长因子(FGF4)、俩者联合、无生长因子四种处理因素，及含2%胎牛血清高糖D施M，1 X胰岛素转铁蛋白硒(ITS)进行诱导培养，并于诱导前及诱导后的第7、14、21、 28天留取细胞涂片或爬片，用RT一PCR法检测肝细胞标志物甲胎蛋白、白蛋白及两种生长因子的受体C一met、FGFRZ mRNA水平的表达，用免疫组化法检测甲胎蛋白、白蛋白、抗肝细胞抗体和CK18的表达，并用PAS法进行糖原染色，分析是否诱导出肝细胞样细胞。统计学数据用均数士标准差(牙士s)表示，采用SPSS10.O统计学软件，用单因素方差分析和t检验对资料进行统计分析。结果密度梯度离心法分离的脐带血单个核细胞，活力及纯度均95%。其中CD34+细胞平均为0.%士0.12%。脐带血间充质干细胞分离24小时后逐渐贴壁，l周后呈长梭形、克隆样生长。流式细胞仪检测结果显示，脐带血间充质干细胞强表达cD29、CD44，不表达 CD34。单个核细胞和间充质干细胞均在诱导前检测到C一met、FGFRZ的少量表达，未检测到甲胎蛋白、白蛋白、抗肝细胞抗体、CK18、糖原的表达。诱导后7天检测出甲胎蛋白mRNA及蛋白水平的表达，21天检测出白蛋白mRNA 及蛋白水平的表达，及CK18、抗肝细胞抗体蛋白水平的表达，随诱导时间的延郑州大学2004年硕士研究生毕业论文体外诱导人脐带血干细胞向肝细胞样细胞分化的研究长C一met，FGFRZ mRNA表达增高，21天、28天均可检测到糖原染色阳性细胞，无生长因子诱导组在以上时间点均未检测到上述指标。 5.统计结果显示，单个核细胞及间充质干细胞HGF+FGF4诱导组甲胎蛋白、白蛋白、CK18、抗肝细胞抗体、糖原阳性率均高于单独生长因子诱导组(P0.05); 上述指标在单独HGF、单独FGF4诱导组间无明显差异(P .05)。结论 1.密度梯度离心法适于分离脐带血单个核细胞，且活率和纯度均较好。 2.密度梯度离心法加贴壁培养法适于分离脐带血间充质干细胞，活率及纯度均较局。 3.人脐带血单个核细胞、间充质千细胞均可在体外诱导分化为具有肝系细胞表型和功能的细胞。 4.HGF、FGF4均能诱导人脐带血干细胞分化为具有肝系细胞表型和功能的细胞，且二者在一定程度上有联合作用。 5.C一met、FGF凡mRNA在诱导前的人脐带血单个核细胞和间充质干细胞均有低水平表达，加生长因子诱导培养后表达水平增高。生长因子与其相应受体之间，可能存在正反馈调节机制。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R329.2

【参考文献】