抗汉坦病毒单克隆抗体可变区基因分析及其噬菌体配体肽的筛选和鉴定

发布时间：2020-06-13 20:22

【摘要】： 目的肾综合征出血热病毒(HFRSV)为布尼亚病毒科汉坦病毒(HV)属成员。因其致病性强，世界卫生组织已将其列为潜在的生物战剂。其中汉滩型(HTN)与汉城型(SEO)在我国广泛分布，引起发病率和病死率较高的肾综合征出血热(HFRS)，每年病例占全球总病例的90%以上。虽然近年来HFRS发病率和病死率在我国呈下降趋势，但疫区仍在不断扩大，并已波及某些中心城市。因而，从分子水平积极开展HFRSV的免疫预防和治疗研究具有重要意义。材料和方法根据鼠源抗体可变区(V)氨基酸序列，设计合成一组抗体重、轻链可变区(VH/VK)简并引物。采用一步法提取单克隆抗体(McAb)H7、B11和F3细胞总RNA，通过RT-PCR扩增V基因，并进行核苷酸序列测定和分析。同时，利用McAb F3及B11，应用噬菌体肽文库筛选特异性的抗体结合肽，夹心ELISA和竞争抑制试验分析获得的噬菌体短肽与筛选配基的结合能力及特异性，阳性克隆序列测定和同源性分析；在此基础上，通过动物免疫试验初步分析噬菌体颗粒抗原的免疫原性。结果通过RT-PCR成功克隆5条可变区基因，均为开放阅读框，符合小鼠抗体框架结构。B11-VH隶属于JH4重排，长345 bp，编码115个氨基酸；H7-VK属JK4重排，长357 bp，编码119个氨基酸；H7-VH属JH4重排，长360 bp，编码120个氨基酸；F3-VK属JK1重排，长348 bp，编码116个氨基酸；F3-VH属JH3重排，长366 bp，编码122个氨基酸。将上述基因核苷酸序列输入GenBank查询，证实为新基因，登记号依次为AY245600~AY245604。同时，应用噬菌体肽文库筛选获得的特异性抗体结合肽阳性率达80%以上，可特异性地与筛选抗体结合。序列分析表明，McAb F3特异性结合肽的推导氨基酸序列高度一致，为MHGPTKNQMWHT，与HFRSV M蛋白G2区第750~759位氨基酸有较高的同源性；而McAb B11特异性的结合肽在氨基酸水平表现出一定的多态性(分为4组)，推测其序列基序为(M/F)HR(H/T)X(H/W)或(R/F)HX(H/T)PWL。阳性克隆动物免疫试验表明，，噬菌体肽抗原不仅具有良好的免疫反应性，而且具有良好的免疫原性，是天然病毒抗原较好的免疫原模拟物。结论上述McAb可变区基因的获得及模拟表位的初步鉴定，为有目的地开展 WP=10 HFRSV基因工程抗体的遗传改造及体外亲和力成熟等研究，以及基于表位的HFRSV多肽疫苗及DNA疫苗的研制奠定了基础。
【图文】：

杂交瘤细胞,总RNA提取

NA；Lane 2：F3 RNA；Lane 3：H7 RNA；La图 1-1 杂交瘤细胞总 RNA 提取Fig1-1 Total RNA of hybridoma H7、B11 and 胶电泳检测 PCR 扩增产物，结果显示 VH小一致(部分结果见图 1-2)。其中，B11在 300~400 bp 间有三条较清晰的扩增片善扩增结果，因而对上述产物进行分段1 2 3 4 5 6 7

可变区基因,凝胶电泳,杂交瘤细胞,产物

RNA；Lane 2：F3 RNA；Lane 3：H7 RNA；Lan图 1-1 杂交瘤细胞总 RNA 提取Fig1-1 Total RNA of hybridoma H7、B11 and F胶电泳检测 PCR 扩增产物，结果显示 VH大小一致(部分结果见图 1-2)。其中，B11，在 300~400 bp 间有三条较清晰的扩增片改善扩增结果，因而对上述产物进行分段1 2 3 4 5 6 7
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2003
【分类号】：R392

【参考文献】