新的肝细胞生长因子（HPPCn）生物活性及作用机制的研究

发布时间：2020-06-24 17:22

【摘要】： 哺乳动物肝脏具有强大的再生能力，在受到物理或化学损伤后，肝脏可以通过再生迅速恢复功能和体积。肝再生是一个复杂的过程，成千上万的物质参与了这个过程。但目前已经发现的肝刺激因子作用靶细胞或靶组织广泛，对肝再生的作用缺乏特异性，仅从这些因子出发很难阐明肝再生的机制。 几十年来，越来越多的证据表明，有特异性刺激肝细胞增殖和肝再生的物质存在。1975年，LaBrecque等从新生大鼠肝脏中分离得到在体内和体外均能够特异促进肝细胞增殖的混合物，并将其命名为肝刺激物(hepatic stimulator substance，HSS)。近30年来，国内外学者对动物及人源HSS的理化性质、生物学性能以及应用前景等都有了较为深入的了解，但始终未能分离纯化获得具有HSS活性的单体组分，对其作用机理的研究也还有待阐明。 近年来，本实验室从新生小牛肝脏HSS中分离得到一种能够促进肝细胞增殖的蛋白因子，并从人胎肝cDNA文库中筛选出其人源序列。我们将这一新的肝细胞生长因子命名为HPPCn(hepatopoietin Cn)。序列分析显示，HPPCn属于富含亮氨酸的酸性核蛋白(Leucine-rich acidic nuclear protein，LANP)家族成员。LANP家族成员作为一类多功能的核蛋白，参与了细胞的增殖、分化、凋亡以及肿瘤抑制等多种生物学过程。但是，作为一种生长因子能够在细胞外起作用，而且影响细胞的增殖状况，目前还未见报道。 HPPCn作为LANP家族成员，在蛋白结构中有两个核定位信号，却没有信号肽。它是怎样到达细胞外并发挥作用的呢?在已有的报道中，也有一些核蛋白(如HMGB1，HDGF等)，没有信号肽，却可以通过非经典途径分泌到细胞外，在增殖、炎症和迁移等生物过程中发挥重要作用。这些证据为HPPCn细胞外功能的研究提供了依据。 本课题报道了HPPCn作为一种新的肝细胞生长因子，在体内和体外均具有特异性的肝刺激活性，并对其作用机制进行了初步探讨。 首先，为了阐明HPPCn与肝再生的关系，我们检测了HPPCn在不同细胞系和组织，以及部分肝切除术后的表达谱。HPPCn呈多细胞、多组织分布，在脑、心、肝和肾中表达水平较高，在人肝癌细胞系SMMC7721细胞中定位于细胞核。小鼠34％肝切除术后，残肝中HPPCn mRNA水平迅速升高，分别于术后2h和24h达峰值，蛋白水平的变化稍慢，12h达峰值，随后缓慢下降。部分肝切除术后HPPCn表达水平的时间动态变化提示HPPCn可能与肝再生过程中肝细胞从G1期向S期的过渡有关。 进而，我们检测了重组蛋白(rhHPPCn)在体内和体外的促增殖活性。rhHPPCn可以促进肝癌细胞系SMMC7721、正常肝细胞系L02和大鼠原代培养肝细胞的~3H-TdR DNA掺入，且具有剂量依赖性。与HSS相似，rhHPPCn对不同细胞促DNA合成作用表现出部分肝特异性。MTT比色试验和流式细胞术检测CFSE标记细胞方法也证明rhHPPCn具有刺激肝细胞增殖的活性。尾静脉注射rhHPPCn(2.5mg／kg体重)可以明显促进34％部分肝切除C57／BL6小鼠残肝~3H-TdR和BrdU的DNA掺入。rhHPPCn可以促进正常小鼠肝脏DNA合成，而对肾、脑和脾没有作用。rhHPPCn可以明显降低CCl_4诱导的急性肝损伤小鼠血清GPT和GOT水平，并可以促进损伤肝脏中PCNA的表达。提示rhHPPCn促进肝再生，并且对CCl_4诱导的急性肝损伤具有保护作用。 最后，我们初步探讨了HPPCn发挥细胞因子作用的可能机制。HPPCn可以在生理条件下分泌。并且外源rhHPPCn可以抑制SMMC7721内源HPPCn的表达，说明HPPCn的表达存在反馈调节。SMMC7721细胞表面可能存在HPPCn的受体，rhHPPCn与其受体的结合具有特异性、可饱和性和可逆性。我们又检测了rhHPPCn对信号通路的激活作用。结果显示，rhHPPCn可以同时激活SMMC7721细胞中的SPK，Erk1／2和Stat3信号分子，可以明显刺激部分肝切除小鼠残肝中Erk1／2的磷酸化。这些实验结果说明HPPCn可能经非经典分泌途径到达细胞外，通过与肝细胞表面受体相互作用，激活以上信号通路实现促进肝细胞增殖的功能。 本研究首次报道了，富含亮氨酸的酸性核蛋白HPPCn，能够作为生长因子在细胞外发挥作用，促进肝细胞的增殖。HPPCn不仅能够特异性刺激大鼠原代培养肝细胞、SMMC7721和L02细胞系的增殖，而且能够促进小鼠手术或化学损伤后的肝再生。这一作用可能是通过肝细胞表面受体，激活细胞内的信号通路来实现的。HPPCn具有与HSS类似的特异性肝刺激活性和肝保护作用，又是一种单一组分的蛋白因子，对HPPCn的研究，不仅有利于阐明肝再生机制，而且有助于为人类肝脏疾病寻找新的临床治疗途径。
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R341
【图文】：

图2:高效液相色谱的纯度检测报告rhHPPCn纯度达到94.2%(图片由崔春萍、杜助君提供)本课题希望回答两个问题:1、HPPCn作为富含亮氨酸的酸性核蛋白，有细胞外刺激肝细胞增殖的活性?2、如果HPPCn可以在细胞外起作用，没有信号肤的情况下，可以在生理状态下分泌吗?其作用机制如何?根据目的，我们对人源HPPCn的表达谱、细胞外活性和在肝再生过程中的作了分析，并对其作用机制进行了初步探讨。

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本文编号：2728163