小鼠腺苷酸环化酶Ⅲ缺失对部分嗅觉受体和相关分子表达的影响

发布时间：2017-03-28 21:03

  本文关键词：小鼠腺苷酸环化酶Ⅲ缺失对部分嗅觉受体和相关分子表达的影响，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：主要嗅表皮(MOE)结构完整性是嗅觉感知的基础,而气味诱导的嗅觉神经元(ORNs)活动是嗅觉系统形成和维持的关键因素。嗅觉受体(ORs)是神经元活动的起点,负责结合气味分子并向下游传递信号。腺苷酸环化酶Ⅲ(AC3)是催化生成第二信使cAMP的最主要的酶,在嗅觉通路中位于ORs的下游。AC3敲除小鼠嗅觉能力及嗅觉相关行为丧失,大量嗅觉相关基因表达异常。在小鼠生后的发育过程中,AC3缺失具体如何影响ORs及相关分子的表达,尚待研究。为了探讨AC3缺失与小鼠生后MOE发育缺陷的关系,本文采用HE技术对出生后不同年龄AC3-/-型和AC3+/+小鼠的MOE组织进行染色,观察AC3缺失对MOE形态发育的影响;采用荧光原位杂交(FISH)技术对AC3-/-和野生型小鼠MOE进行OMP、OR基因的杂交,以明确AC3缺失对ORNs发育成熟和ORs表达的影响;并对MOE发育及ORs表达相关的转录因子Lhx2和Emx2、转运蛋白RTP、辅助蛋白REEP1以及偶联G蛋白辅助因子Ric-8b进行差异表达分析。发现AC3缺失对MOE组织出生后发育和OR表达的重要影响。具体内容如下:1.AC3缺失导致小鼠出生后至成年的发育过程中MOE厚度逐渐变薄,成熟ORNs数量逐渐减少,至小鼠成年时MOE严重受损。2.对AC3-/-小鼠MOE中ORs基因的表达进行分析,发现ORs在MOE发育过程中,OR+-ORNs数量极显著下调,单个ORNs亮度也明显减弱,且下调随年龄增加渐趋严重,而表达区域未发生改变。3.对MOE中Rtp1、Rtp2、Reep1、Lhx2、Emx2和Ric-8b等基因的表达进行分析,AC3缺失后这些嗅觉发育相关基因均发生不同程度的显著下调。总之,在小鼠出生后,AC3缺失导致MOE形态结构逐渐缺陷;不同染色体座位和表达分布区域的ORs显著下调,降低气味诱导的神经元活动及ORs相关因子表达下调,这可能是ORs表达下调和MOE发育受损的部分原因。本文不仅为研究外围嗅觉系统的发育和维持提供基础,也为深入了解嗅觉障碍提供一定理论依据。
【关键词】：嗅觉发育 MOE AC3 OR 荧光原位杂交
【学位授予单位】：河北大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R339.12
【目录】：

• 摘要5-6
• Abstract6-13
• 引言13-14
• 第1章 文献综述14-27
• 1.1 MOE简介14-16
• 1.1.1 MOE可终生再生14
• 1.1.2 MOE的结构14-15
• 1.1.3 嗅觉信号的形成15-16
• 1.2 AC3与嗅觉16-18
• 1.2.1 AC3缺失导致嗅觉障碍16-17
• 1.2.2 AC3调控嗅纤毛模式的建立与维持17-18
• 1.3 OR简介18-23
• 1.3.1 OR基因的进化、分类与分布18-21
• 1.3.2 OR气味识别的结构基础21-23
• 1.4 ORS功能表达相关辅助因子23-26
• 1.4.1 气味结合蛋白OBPs23
• 1.4.2 ORs相关转录因子23-24
• 1.4.3 ORs蛋白表达及功能相关的辅助因子24-26
• 1.5 本文研究的目的和意义26-27
• 第2章 AC3~(-/-)小鼠MOE形态发育的研究27-46
• 2.1 实验材料与试剂27-31
• 2.1.1 实验动物27
• 2.1.2 仪器27-28
• 2.1.3 试剂28-29
• 2.1.4 溶液29-31
• 2.2 实验方法31-39
• 2.2.1 灌流小鼠和取材31
• 2.2.2 制备冷冻切片31-32
• 2.2.3 MOE组织冷冻切片HE染色32-33
• 2.2.4 小鼠MOE组织中总RNA的提取33
• 2.2.5 cDNA的合成33-34
• 2.2.6 基因克隆34-35
• 2.2.7 PCR产物酶切、连接、转化及重组载体提取鉴定35
• 2.2.8 质粒线性化及体外转录35-36
• 2.2.9 探针纯化与鉴定36-37
• 2.2.10 原位杂交37-38
• 2.2.11 数据统计与处理38-39
• 2.3 实验结果39-44
• 2.3.1 不同年龄小鼠MOE的HE染色结果39-41
• 2.3.2 OMP原位杂交探针制备41-42
• 2.3.3 OMP-FISH42-44
• 2.4 讨论44-46
• 第3章 AC3~(-/-)小鼠出生后MOE发育过程中OR表达的研究46-60
• 3.1 实验材料与试剂46
• 3.1.1 实验动物46
• 3.1.2 仪器46
• 3.1.3 试剂46
• 3.1.4 溶液46
• 3.2 实验方法46-50
• 3.2.1 小鼠MOE组织中总RNA的提取46
• 3.2.2 cDNA的合成46-47
• 3.2.3 qRT-PCR实验47-48
• 3.2.4 小鼠灌注取材48
• 3.2.5 冷冻切片组织处理与切片48-49
• 3.2.6 基因克隆49
• 3.2.7 PCR产物酶切、连接、转化及重组载体提取鉴定49
• 3.2.8 质粒线性化及体外转录49
• 3.2.9 探针鉴定与纯化49
• 3.2.10 原位杂交49-50
• 3.2.11 数据统计与处理50
• 3.3 实验结果50-58
• 3.3.1 不同年龄小鼠MOE中OR-FISH结果50-56
• 3.3.2 OR-FISH结果统计与分析56-57
• 3.3.3 qRT-PCR检测AC3~(-/-)小鼠MOE的ORs表达57-58
• 3.4 讨论58-60
• 第4章 AC3缺失对MOE内嗅觉相关分子的影响60-64
• 4.1 实验材料与试剂60
• 4.1.1 实验动物60
• 4.1.2 仪器60
• 4.1.3 试剂60
• 4.1.4 溶液60
• 4.2 实验方法60-61
• 4.2.1 小鼠MOE组织中总RNA的提取60
• 4.2.2 cDNA的合成60
• 4.2.3 qRT-PCR实验60-61
• 4.3 实验结果61-62
• 4.3.1 AC3缺失引起OR相关基因的差异表达61-62
• 4.4 讨论62-64
• 结论64-65
• 参考文献65-73
• 致谢73-74
• 读研期间发表的论文74

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