肠炎沙门菌和雏沙门菌fimH基因缺失株的构建及相关功能性分析

发布时间：2017-03-28 20:19

  本文关键词：肠炎沙门菌和雏沙门菌fimH基因缺失株的构建及相关功能性分析，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：肠炎沙门菌是一种重要的人畜共患病病原菌,具有广泛的宿主谱,能引起人和动物肠道或全身性疾病。雏沙门菌属于专嗜性病原菌,可引起不同日龄的鸡感染发病,耐受鸡长期带菌且生长发育迟缓,给养禽业造成巨大的经济损失,同时也严重威胁人和动物的健康。沙门菌属经口感染宿主,然后通过对肠上皮细胞或位于派氏结淋巴组织的侵袭,将感染的吞噬细胞移动到淋巴细胞,细菌在此开始繁殖。在此过程中,沙门菌对宿主细胞的黏附是引起宿主致病的先决条件。鉴于FimH的功能研究大多集中在尿道致病性大肠杆菌(Uropathogenic Escherichia coli, UPEC)对尿道表皮细胞的黏附方面,而对肠炎沙门菌和雏沙门菌致病进程中FimH所参与的生物学功能却鲜有报道。本研究以I型菌毛fimH基因为切入点,探究其在肠炎沙门菌和雏沙门菌中所发挥的生物学功能。通过构建肠炎沙门菌I型菌毛主要亚单位FimA原核表达载体,并制备鼠源多克隆抗体,利用Western-Blot验证肠炎沙门菌和雏沙门菌I型菌毛的表达。本研究通过比对GenBank上沙门菌I型菌毛fimH基因序列,设计一对PCR引物扩增肠炎沙门菌CMCC(B)50336和雏沙门菌15218 Ⅰ型菌毛的fimH基因序列,根据PCR测序结果设计一对同源重组引物,其5’端与fimH基因序列两侧同源,而3’端与氯霉素抗性基因cat表达盒同源。利用λ噬菌体-Red同源重组系统对肠炎沙门菌标准株CMCC(B)50336和雏沙门菌标准株15218的fimH基因进行敲除。首先,以质粒pKD3为模板扩增含有氯霉素抗性的PCR产物,经纯化后分别电转化至含质粒pKD46的肠炎沙门菌CMCC(B)50336和雏沙门菌15218中,在Red同源重组酶Exo、Beta、Gam的作用下,含有氯霉素抗性基因片段的产物借助两翼同源序列与染色体上的靶基因发生重组,置换fimH基因,分别获得一次重组菌50336 △fimH::cat和15218△fimH::cat。在二次重组中,将编码FLP重组酶的质粒pCP20分别电转化入50336△fimH::cat、15218△fimH::cat突变株中,通过对cat阅读框两侧的FLP位点的识别,从而消除氯霉素抗性基因。最后通过PCR检测和DNA测序结果,验证缺失株50336△fimH和15218△ fimH成功构建。血凝试验和酵母凝集试验表明,肠炎沙门菌能发生明显的凝集现象,而fimH缺失突变株丧失凝集能力。生物被膜定性和定量试验证明FimH促进肠炎沙门菌生物被膜的形成。此外,在肠炎沙门菌中,FimH促进对禽巨噬细胞HD-11的黏附。然而,雏沙门菌既不能与红细胞和酵母细胞发生凝集反应,也不能对禽巨噬细胞进行黏附。Real-Time PCR试验结果显示,fimH缺失上调了卷曲菌毛主要调节子csgD和外膜蛋白ompD的转录。综上所述,肠炎沙门菌Ⅰ型菌毛FimH参与对红细胞凝集、生物被膜的形成以及在禽巨噬细胞的黏附方面发挥重要作用,而雏沙门菌Ⅰ型菌毛FimH则丧失了对红细胞凝集、生物被膜的形成以及对禽巨噬细胞的黏附能力。
【关键词】：肠炎沙门菌 雏沙门菌 Ⅰ型菌毛 fimA基因 fimH基因 生物被膜 黏附
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.61;R378
【目录】：

• 中文摘要3-4
• Abstract4-11
• 符号说明11-12
• 沙门菌的毒力因子与致病机理12-27
• 1 沙门菌属12
• 2 沙门菌属的分类12
• 3 沙门菌的微生物学诊断12-13
• 4 沙门菌属的致病机理13-14
• 5 沙门菌的毒力因子14-16
• 5.1 沙门菌毒力岛(Salmonella pathogenicity islands,SPIs)14-15
• 5.2 pSLT质粒15
• 5.3 黏附素15-16
• 5.4 鞭毛和趋化性16
• 5.5 生物被膜与慢性感染16
• 6 总结与展望16-17
• 参考文献17-27
• 研究一：肠炎沙门菌和雏沙门菌fimH缺失株的构建27-42
• 1 材料29-30
• 1.1 菌株与质粒29-30
• 1.2 培养基和主要试剂30
• 1.3 主要仪器30
• 2 方法30-35
• 2.1 fim H基因缺失引物设计30
• 2.2 氯霉素抗性基因PCR产物的制备和纯化30-31
• 2.3 肠炎沙门菌和雏沙门菌感受态细胞的制备和质粒pKD46的转化31-32
• 2.4 Red同源重组酶的诱导和感受态细胞制备32
• 2.5 含同源臂的氯霉素抗性基因PCR产物的电转化32-33
• 2.6 质粒pKD46的消除33
• 2.7 第一次同源重组菌50336ΔfimH：：cat和15218ΔfimH.::cat的PCR鉴定33-34
• 2.8 FLP位点专一性重组34
• 2.9 第二次同源重组菌的鉴定34-35
• 3 结果35-39
• 3.1 肠炎沙门菌与雏沙门菌fimH测序结果分析35-36
• 3.2 融合PCR产物的制备36-37
• 3.4 第二次重组菌50336ΔfimH和15218ΔfimH的PCR鉴定37-38
• 3.5 fimH基因缺失株的序列分析38-39
• 4 讨论39
• 参考文献39-42
• 研究二：肠炎沙门菌Ⅰ型菌毛主要亚单位FimA表达纯化及多克隆抗体的制备42-54
• 1 材料43-44
• 1.1 菌株、质粒43
• 1.2 实验动物43
• 1.3 培养基和主要试剂43
• 1.4 主要仪器43-44
• 2 方法44-46
• 2.1 引物设计与合成44
• 2.2 PCR模板的制备44
• 2.3 目的基因fimA PCR扩增体系与程序44
• 2.4 目的基因fimA的克隆与鉴定44
• 2.5 pET-28α(+)-fimA重组表达载体的构建44-45
• 2.6 FimA重组蛋白的表达和纯化45-46
• 3 结果与分析46-51
• 3.1 fimA基因扩增产物的鉴定46-47
• 3.2 pET-28a(+)-挪重组表达质粒的鉴定47-48
• 3.3 pET-28α(+)-fimA重组蛋白表达优化48
• 3.4 FimA重组蛋白的表达形式分析和纯化48-50
• 3.5 重组蛋白FimA Western-Blot鉴定50
• 3.6 FimA鼠源多克隆抗体的制备及鉴定50-51
• 4 讨论51-52
• 参考文献52-54
• 研究三：肠炎沙门菌和雏沙门菌Ⅰ型菌毛亚单位fimH基因缺失突变株的相关功能性分析、54-74
• 1 材料55-56
• 1.1 菌株、质粒、细胞系55
• 1.2 主要试剂55-56
• 1.3 仪器设备56
• 1.4 试验动物56
• 2 方法56-61
• 2.1 细菌生化鉴定56
• 2.2 细菌血清型鉴定试验56
• 2.3 野生株以及fimH突变株生长试验测定56-57
• 2.4 毕赤酵母凝集试验和凝集抑制试验57
• 2.5 血凝试验(HA)和甘露糖敏感性血凝抑制试验(MSHA)57
• 2.6 半固体运动性试验57
• 2.7 生物被膜的定性试验57-58
• 2.8 生物被膜定量试验58
• 2.9 菌株耐药性试验58
• 2.10 HD-11细胞黏附试验58-59
• 2.11 Real-Time PCR定量分析试验59-61
• 3 结果61-69
• 3.1 细菌生化鉴定实验61-62
• 3.2 细菌的血清型鉴定试验62-63
• 3.3 生长曲线测定63
• 3.4 毕赤酵母凝集试验和凝集抑制试验63-64
• 3.5 血凝试验(HA)和甘露糖敏感性血凝抑制试验(MSHA)64-65
• 3.6 半固体运动性试验65
• 3.7 生物被膜定性试验65
• 3.8 生物被膜定量试验65-66
• 3.9 菌株耐药性试验66
• 3.10 HD-11细胞黏附试验66-67
• 3.11 Real-Time PCR定量分析试验67-69
• 4 讨论69-70
• 参考文献70-74
• 全文小结74-75
• 致谢75-76
• 攻读硕士期间发表的学术论文76-77

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