幽门螺杆菌HpaA-VacA融合蛋白卵黄抗体的制备及生物活性研究

发布时间：2017-03-29 17:23

  本文关键词：幽门螺杆菌HpaA-VacA融合蛋白卵黄抗体的制备及生物活性研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的通过基因工程方法构建幽门螺杆菌黏附素(HpaA)、细胞空泡毒素(Vac A)及Hpa A-Vac A融合蛋白作为免疫原,免疫蛋鸡制备特异性卵黄抗体(Ig Y),并研究其生物活性,为Hp感染的治疗与预防开辟了一条新路径,同时也为制备抗Hp感染的制剂奠定基础。方法与结果1.采用PCR方法分别克隆幽门螺杆菌Hpa A、Vac A及Hpa A-Vac A融合基因。克隆载体酶切和测序结果均显示,Hp Hpa A、Vac A和Hpa A-Vac A融合基因成功克隆到p GEM-3Z质粒中。2.通过DNA重组技术分别构建Hp Hpa A、Vac A和Hpa A-Vac A融合基因的原核表达系统。SDS-PAGE结果表明,以上原核表达系统构建成功,且Hpa A、Vac A和Hpa A-Vac A融合蛋白均高效表达。3.通过亲和层析法纯化Hpa A、Vac A及Hpa A-Vac A融合蛋白,SDS-PAGE分析其纯度,Western blot鉴定其免疫学活性。结果显示,纯化后的三种重组蛋白纯度均达到90%以上,且均能够被Hp感染病人的血清所识别,即三种融合蛋白都具有良好的免疫学活性。4.以纯化的Hpa A、Vac A及Hpa A-Vac A融合蛋白分别免疫蛋鸡,分离提纯Ig Y,鉴定其生物学活性。SDS-PAGE测定Ig Y纯度均为85%左右;Western blot显示Ig Y都具有良好的免疫特异性即能与相应的抗原发生特异性结合;间接ELISA结果显示,Hpa A-Ig Y效价为1:12800;Vac A-Ig Y效价为1:12800;Hpa A-Vac A-Ig Y效价为1:6400;而Hpa A-Vac A-Ig Y分别与Hpa A和Vac A抗原反应,效价可达1:6400和1:3200。结论本文主要通过基因工程及动物免疫的方法成功制备出高效价的抗幽门螺杆菌的特异性Hpa A-Ig Y、Vac A-Ig Y、Hpa A-Vac A-Ig Y,并研究比较了其生物学活性,证实其均具有良好的免疫学活性,从而为制备集预防与治疗为一体的抗幽门螺杆菌感染的制剂奠定基础。
【关键词】：幽门螺杆菌 黏附素HpaA 细胞空泡毒素VacA HpaA-VacA融合基因 IgY
【学位授予单位】：广东药学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-8
• 前言8-11
• 实验流程11-12
• 第一章 幽门螺杆菌HpaA、VacA和融合基因HpaA-VacA克隆12-32
• 一、材料与方法12-24
• 1 实验材料12-15
• 2 实验方法15-24
• 二、结果24-30
• 1 Hp HpaA基因的克隆与测序24-25
• 2 Hp VacA基因的克隆与测序25
• 3 Hp HpaA-VacA融合基因的克隆与测序25-30
• 三、讨论30-32
• 第二章 HpaA、VacA和融合基因HpaA-VacA原核表达载体构建及蛋白表达活性研究32-50
• 一、材料与方法32-40
• 1 实验材料32-35
• 2 实验方法35-40
• 二、结果40-48
• 1 HpaA、VacA和HpaA-VacA融合基因的诱导表达结果40
• 2 pQE30-HpaA-VacA工程菌表达条件优化结果40
• 3 融合蛋白的纯化及其纯度测定40-41
• 4 纯化目的蛋白Western blot结果41-48
• 三、讨论48-50
• 第三章 卵黄抗体IgY的制备及其生物学活性测定50-58
• 一、材料与方法50-52
• 1 实验材料50-51
• 2 实验方法51-52
• 二、结果52-56
• 1 IgY纯度52
• 2 IgY的Western blot结果52
• 3 IgY效价52-56
• 三、讨论56-58
• 全文总结58-60
• 1 创新点58
• 2 研究展望58-60
• 参考文献60-65
• 附录65-73
• 附录一 缩略词中英文对照65-66
• 附录二 硕士期间发表的论文66
• 附录三 序列图66-73
• 致谢73

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

1 文冰;危由春;蒋泽先;张进;聂荣庆;;特异性抗幽门螺杆菌IgY的制备和活性测定[J];南昌大学学报(医学版);2010年06期

2 许杨,熊勇华,魏华,钟青萍,陈红兵,孙红斌;幽门螺杆菌全菌抗原对母鸡的免疫原性[J];中国生物制品学杂志;2000年03期

3 谢献胜;王峰;周新民;刘俊栋;卢炜;周冬仁;;抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体的制备及其体外抑菌试验[J];中国家禽;2005年13期

4 陈翠萍,杨朝晖,王永谦;IgY抗体在体外和体内对幽门螺杆菌作用的研究[J];中华微生物学和免疫学杂志;2002年01期

  本文关键词：幽门螺杆菌HpaA-VacA融合蛋白卵黄抗体的制备及生物活性研究，由笔耕文化传播整理发布。

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本文编号：275030