体外诱导人骨髓间充质干细胞及其亚群HLA-DR～-C-Kit～-细胞向肝系细胞分化的实验研究

发布时间：2020-07-11 17:53

【摘要】：对于各种终末期肝病，临床上主要采取基础疗法和对症治疗，肝移植作为治疗急、慢性肝衰竭的有效手段，由于供肝缺乏、费用昂贵、免疫排斥等问题，使其临床应用受限。虽然生物人工肝对改善终末期肝病患者症状、延缓预后有一定作用，但由于肝细胞来源匮乏，限制了其临床应用，肝细胞移植治疗也因肝细胞来源所限而停滞不前。目前迫切需要找到一种高效治疗肝病的措施，或解决肝细胞的来源问题。干细胞研究的进展为利用干细胞移植和／或干细胞工程生产肝细胞来治疗各种肝病提供了可能性。目前干细胞研究领域中最受重视的是对骨髓干细胞的研究。骨髓中有两类干细胞，一类是造血干细胞(hematopoietic stem cells，HSCs)，另一类是间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)。骨髓MSCs来源于中胚层，具有很强的自我复制能力，能产生具有各种表型的子代细胞，在特定的诱导条件下可分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、成肌细胞和神经细胞等。骨髓MSCs一方面因其取材方便对身体健康损害小，另一方面用自体干细胞诱导构建的组织不存在MHC限制，所以日益受到重视。最近通过细胞移植显示，在体内骨髓MSCs也有形成肝细胞的能力。因此，本课题旨在体外培养人骨髓间充质干细胞及其亚型HLA-DR~-C-Kit~-细胞，观察HGF、FGF4以及两者联用对培养的人骨髓MSCs及HLA-DR~-C-Kit~-细胞的作用，寻找影响和调节这两类细胞向肝细胞样细胞定向分化的最佳条件，探讨体外诱导培养获取具有表型和功能特征的肝细胞样细胞的可能性，如果诱导成功，可为现代细胞工程学提供新的细胞来源，为临床上终末期肝病的治疗带来新的希望。郑州大学2004年硕士研究生毕业论丈体外诱导人甘髓间充质干细胞及其亚群lILA~DRC一kif细胞向肝系细胞分化的实验研究材料和方法骨髓细胞来源于健康志愿者的胸骨，年龄2一35岁。本实验分两组:A组:骨髓间充质干细胞组;B组:HLA一DR一C一Kit一细胞组。A组细胞通过密度梯度离心(密度 1.0779/ml)获得。在细胞达到对数生长期后传至第三代时，用流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞的纯度。B组细胞为第三代的A组细胞用磁式分离仪分离获得。以上两组细胞在达到对数生长期之前用含10%胎牛血清的DMEM培养基(低糖)培养，在细胞达到对数生长期后开始诱导时，接种于预先铺有爬片的24孔培养板中，爬片预先用1林g/m1F’N (纤维连接素)处理，用含5%FBS、1 X ITS(胰岛素一转铁素一硒混合物)、lmg/m1BSA (牛血清白蛋白)、4.7林g/ml亚油酸、10一SM几地塞米松、10一树L抗坏血酸、loou/ml 青霉素、100U/m1链霉素以及10ng/m1EGF的DF培养基培养，根据所加生长因子的不同又各分为四组:HGF(HePatoeyte即o，几h factor，肝细胞生长因子)组、FoF4(Fibroblast grov改h factor一4，纤维母细胞生长因子一4)组、HGF+FGF4组以及无生长因子组，每组设 12个复孔。以上各组细胞接种密度为2 xl护/c mZ，分别留取新鲜分离的细胞及各组诱导培养后O天、7天、14天、21天、28天时的细胞，用免疫细胞化学方法检测肝系细胞的特异性标志:CK18、AFP、白蛋白以检测诱导后的细胞表型，用PAS法进行糖原染色检测诱导后的细胞功能，Rl，一PCR法检测新鲜分离的骨髓细胞中AFP、C一met(HGF受体)、 FGFRZ(FGF4受体)的mRNA表达情况。统计学分析:各指标的阳性表达情况在不同时间点、不同组、不同处理因素之间的比较，阳性率以无勺表示，以。=0.05为检验水准，用sPsslo.o软件分析，采用重复测量数据方差分析进行统计。结果 1密度梯度离心法分离的人骨髓细胞，大小均匀，透亮度好，台盼蓝染色细胞活率95%。细胞达到对数生长期后传至第三代后，用流式细胞仪检测细胞表面抗原CD29 和CD44，表达率分别为90.6%和91 .5%，说明分离的人骨髓间充质干细胞纯度较高。 2磁式分离仪所得的HLA一DR一C一擞t一细胞，在倒置显微镜下观察，细胞透亮度好，台盼蓝染色细胞活率95%。 3人骨髓MSCs24小时内贴壁，以后逐渐增多，细胞成克隆性生长，3天时可见郑州大学2004年硕士研究生毕业论文体外诱导人骨做间充质干细胞及其亚群HLA一D玄C一kif细胞向肝系细胞分化的实验研究到呈梭形的细胞，10天左右可达到对数生长期。进行磁式分离后，细胞24小时内迅速贴壁、伸展，增殖迅速，3一4天即可达对数生长期。 4在细胞培养过程中发现单用HGF诱导时细胞增殖速度慢，而单用FGF4及联用HGF和FGF4诱导时细胞增殖速度较快。 5新分离的细胞及两组细胞在诱导0天时均未检测到肝系细胞的标志，然而用 RT一PCR法可在新分离的骨髓细胞中检测到AFP以及c一met和FGFRZ mRNA表达。 6两组细胞用含生长因子的培养基培养后均可检测到肝系细胞的标志，而不含生长因子的培养基培养后未检测到相应标志的表达。 7统计学分析显示，CK18、AFP、白蛋白以及糖原这四个指标的阳性率在两组之间均无明显差异沙0.05)，在单用HGF、单用FGF4或两者联用时也无明显差异印0.05)，各指标的阳性率随培养时间的变化而有差异印0.01)。结论 1密度梯度离心法适于分离人骨髓间充质干细胞，且活率和
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R329.2

【参考文献】