弓形虫ROP16的表达及其调控宿主细胞凋亡的研究

发布时间：2017-03-29 18:25

  本文关键词：弓形虫ROP16的表达及其调控宿主细胞凋亡的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:将弓形虫棒状体16蛋白在体外表达并将其纯化后,制备兔抗多克隆抗体。构建ROP16真核表达载体并转染入293T细胞,使其成功表达ROP16蛋白,探讨ROP16对293T细胞凋亡的影响。方法:分别构建重组质粒ROP16/p TG19-T和ROP16/p ET32a,并于Rosetta中诱导表达。通过KCl染色切胶法对重组蛋白进行纯化,制备多克隆抗体,并用Western blotting和IFA技术分别对其进行鉴定。构建ROP16真核表达重组质粒p3XFLAG-Myc-CMV?-24-ROP16,并用PCR和双酶切法进行鉴定,提取无内毒素阳性质粒。采用瞬时转染法使得重组蛋白在293T细胞中表达,在三个不同时间点收集标本,用Wenstern blotting和RT-PCR法检测分别定量和定性检测ROP16在293T细胞内的表达。将293T细胞接种于培养板中,待细胞长至60%左右(≤24h),向细胞中转染空载质粒和p3XFLAG-Myc-CMV?-24-ROP16重组质粒。使用0.5μg/ml Act D诱导凋亡。于转染后24 h、48 h收集标本,分别用于以下实验:将标本用Annexin V-FITC/PI染色以及TUNEL Bright Green试剂盒染色,检测凋亡率。提取标本中RNA并反转录为c DNA,RT-PCR法检测Bcl-2/Bax及Caspase3的变化。结果:成功扩增出ROP16基因片段并构建ROP16原核表达重组质粒。电泳结果显示99.8 k Da处有符合大小的条带。将纯化后重组蛋白免疫家兔并获得多克隆抗体。Western blotting结果显示在74 k Da处有符合大小条带,IFA结果显示目的蛋白的绿色荧光分布在弓形虫速殖子的胞质内,具体位置为细胞核前端。成功构建真核表达重组载体p3XFLAG-Myc-CMV?-24-ROP16,转染293T细胞后三个时间点的样本经Western blotting均能检测出符合大小的条带,根据条带的粗细判断蛋白表达量与时间成正比。数据统计结果显示,转染ROP16的实验组凋亡率均低于对照组,并且在24h、48h两组差别有统计学意义(P0.05)。转染后24 h、48 h,ROP16转染组Bcl-2/Bax明显高于空载转染组(P0.05)。ROP16转染组Caspase3与actin比值明显低于空载转染组(P0.05)。结论:成功构建了原核表达重组质粒ROP16/p ET32a,并制备ROP16兔抗多克隆抗体,对多克隆抗体分别进行定性和定量分析,证明其具有较高的免疫反应活性。ROP16蛋白在宿主细胞中成功表达,并且对宿主细胞凋亡有抑制作用。
【关键词】：弓形虫 ROP16 原核表达 293T细胞 凋亡
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R382.5
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-13
• 主要缩略词表13-14
• 第一章 绪论14-18
• 1.1 弓形虫入侵机制14
• 1.2 弓形虫入侵相关蛋白14-15
• 1.3 弓形虫感染与细胞凋亡15
• 1.4 ROP16研究现状15-16
• 1.5 本课题意义16-18
• 第二章 弓形虫ROP16的原核表达18-42
• 2.1 实验仪器和材料18-23
• 2.1.1 实验仪器18
• 2.1.2 实验耗材18
• 2.1.3 实验试剂18-19
• 2.1.4 试剂配制19-23
• 2.1.5 载体与菌株23
• 2.1.6 细胞和虫体23
• 2.2 实验方法23-34
• 2.2.1 HFF细胞系的传代培养23
• 2.2.2 弓形虫速殖子的培养23-24
• 2.2.3 弓形虫速殖子DNA提取24
• 2.2.4 弓形虫ROP16基因的扩增24-26
• 2.2.5 弓形虫ROP16/pTG19-T载体的构建与鉴定26-28
• 2.2.6 ROP16/pET32a原核表达载体的构建与鉴定28-30
• 2.2.7 ROP16蛋白的表达与纯化30-34
• 2.3 结果34-40
• 2.3.1 弓形虫ROP16基因的扩增34
• 2.3.2 ROP16/pTG19-T重组质粒鉴定34-36
• 2.3.3 ROP16/pET32a重组质粒鉴定36-37
• 2.3.4 ROP16重组蛋白诱导表达及可溶性分析37-39
• 2.3.5 Ni-NTA亲和层析纯化法纯化目的蛋白39
• 2.3.6 KCl染色切胶法纯化ROP16重组蛋白39-40
• 2.4 讨论40-42
• 第三章 ROP16多抗的制备与鉴定42-52
• 3.1 实验仪器和材料42-45
• 3.1.1 实验仪器42
• 3.1.2 实验动物42
• 3.1.3 实验耗材42
• 3.1.4 试剂及其配制42-45
• 3.1.5 细胞和虫体45
• 3.2 实验方法45-48
• 3.2.1 ROP16多克隆抗体的制备45-47
• 3.2.2 ROP16多克隆抗体的鉴定47-48
• 3.3 结果48-50
• 3.3.1 ELISA检测多克隆抗体效价48-49
• 3.3.2 Western blotting检测多克隆抗体49
• 3.3.3 IFA检测弓形虫ROP16的表达49-50
• 3.4 讨论50-52
• 第四章 弓形虫ROP16的真核表达52-64
• 4.1 实验仪器和材料52-53
• 4.1.1 实验仪器52
• 4.1.2 实验耗材52
• 4.1.3 实验试剂及其配制52
• 4.1.4 载体与菌株52
• 4.1.5 细胞和虫体52-53
• 4.2 实验方法53-59
• 4.2.1 ROP16真核表达载体的构建及鉴定53-55
• 4.2.2 p3XFLAG-Myc-CMV?24ROP16质粒和空质粒的大量提取55
• 4.2.3 293T细胞的复苏与培养55-56
• 4.2.4 p3XFLAG-Myc-CMV?24ROP16转染 293T细胞56
• 4.2.5 Western blotting法检测ROP16的表达56-57
• 4.2.6 RT-PCR法检测ROP16在 293T细胞中的表达57-59
• 4.3 结果59-61
• 4.3.1 ROP16真核表达载体的PCR和双酶切鉴定59-60
• 4.3.2 ROP16在 293T细胞内表达的检测60-61
• 4.4 讨论61-64
• 第五章 ROP16对 293T细胞凋亡的影响64-76
• 5.1 实验仪器与材料64-65
• 5.1.1 实验仪器64
• 5.1.2 实验耗材64
• 5.1.3 实验试剂及配制64-65
• 5.1.4 细胞65
• 5.2 实验方法65-70
• 5.2.1 293T细胞的复苏与培养65
• 5.2.2 293T细胞的转染与凋亡的诱导65
• 5.2.3 Annexin V-FITC/PI法检测 293T细胞凋亡65-66
• 5.2.4 TUNEL法检测 293T细胞凋亡66-67
• 5.2.5 RT-PCR法检测凋亡相关基因67-70
• 5.3 结果70-74
• 5.3.1 AnnexinV-FITC/PI法检测细胞凋亡70-71
• 5.3.2 TUNEL法检测细胞凋亡71-72
• 5.3.3 凋亡相关因子Bcl-2、Bax的检测72-73
• 5.3.4 凋亡相关因子Caspase3的检测73-74
• 5.4 讨论74-76
• 结论与展望76-78
• 参考文献78-86
• 致谢86-88
• 读研期间发表论文、参加课题88-89

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  本文关键词：弓形虫ROP16的表达及其调控宿主细胞凋亡的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

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