家蝇CCTζ基因的cDNA克

发布时间：2020-07-13 20:07

【摘要】：目的:从家蝇的EST测序数据库中筛选获得家蝇的CCT(chaperonin containing t-complex polypeptide)基因MD-CCTζ,上传Gen Bank分析分子特性后,进行c DNA克隆、表达;探讨MD-CCTζ基因在家蝇不同组织和发育时期的时空表达模式;初步研究在不同病原微生物和热胁迫条件下家蝇3龄幼虫的MD-CCTζ基因表达谱的变化。方法:1、MD-CCTζ的序列分析及c DNA克隆、表达。从课题组前期构建的家蝇幼虫EST数据库中筛选得到家蝇的CCTζ基因序列,通过序列分析,预测其开放阅读框,采用BLAST、EXPASY等生物信息学网站分析预测MD-CCTζ基因编码蛋白的结构域,二级及三级结构等;从NCBI上下载其他物种CCTζ基因的氨基酸序列,借助MEGA 6.0软件采用邻接法构建系统进化树;根据其c DNA序列设计引物,PCR扩增MD-CCTζ基因,将目的基因与表达载体PEASY-E1构建重组质粒,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,选择合适温度、时间使用IPTG诱导重组蛋白,重组蛋白使用His·Tag融合蛋白试剂盒纯化。2、家蝇CCTζ基因的时空表达分析。分别收集家蝇生活史各发育阶段不同虫态(卵、1龄幼虫、2龄幼虫、3龄幼虫、蛹),成虫不同性别(雌虫和雄虫)的虫体,提取总RNA后并逆转录为c DNA,以GAPDH基因为内参基因,采用实时荧光定量PCR(Real Time PCR)技术检测MD-CCTζ基因不同发育时期的表达差异;解剖家蝇3龄幼虫,选择幼虫的六种具有典型特征的组织器官(脂肪体、唾液腺、中肠、气管、马氏管和体壁)。提取相应组织的总RNA并转录为c DNA。采用Real Time PCR检测MD-CCTζ基因的空间表达差异。3、MD-CCTζ基因在家蝇3龄幼虫胁迫条件下的功能初探。分别将定量的不同病原微生物(白色念珠菌、大肠杆菌和及金黄色葡萄球菌)采用注射法导入到家蝇3龄幼虫体内,采用Real Time PCR检测诱导后不同时间点(3h、6h、12h、18h、24h、36h、48h)CCTζ基因表达水平的变化。将3龄幼虫42℃热胁迫,采用Real Time PCR检测胁迫(0h、15min、30min、1h、1.5h、2h)后不同时间点MD-CCTζ基因表达水平的变化。结果:1、生物信息学分析结果显示,MD-CCTζ的ORF框全长1596 bp,编码一个含531个氨基酸的蛋白多肽,理论分子量为58260.47Da,等电点为6.56;无信号肽和跨膜结构域,有2个CCT蛋白标签,具有CCT的功能结构域,MD-CCTζ的三级结构有多个α螺旋和β折叠,通过不规则卷曲相连,进化树比对分析与地中海实蝇CCT的遗传距离较近。成功构建了MD-CCTζ表达载体,经IPTG诱导,重组蛋白获得表达,并得到纯化蛋白。2、MD-CCTζ基因在家蝇体内的时空表达模式结果显示,在家蝇卵、各龄幼虫、蛹和雌雄成虫各阶段中,MD-CCTζ基因有不同程度的表达。MD-CCTζ基因在卵期表达量最高,其表达水平排列为卵雌虫2龄幼虫1龄幼虫蛹雄虫3龄幼虫。3、家蝇3龄幼虫的各主要组织中,MD-CCTζ基因在唾液腺和气管中的表达水平明显比体壁、脂肪体、中肠和马氏管高,MD-CCTζ基因在各组织表达量为:唾液腺气管马氏管中肠脂肪体体壁。4、大肠杆菌诱导后MD-CCTζ在3h开始轻微上调,到6h、18h、36h出现下调,在12h、24h、48h为上调状态,24h表达量最高。金黄色葡萄球菌、白色念珠菌诱导后在24h表达量最高,其它时间点MD-CCTζ基因表达趋于基础免疫状态。5、家蝇3龄幼虫在热胁迫条件下的MD-CCTζ基因在15min后上调,在2h显著上调表达。结论:1、本研究成功对MD-CCTζ基因分子特性进行了分析、克隆并表达了MD-CCTζ基因,得到了体外重组蛋白。2、初步揭示了MD-CCTζ基因在家蝇体内的时空表达模式,提示MD-CCTζ基因在家蝇生长发育过程中具有重要作用。3、MD-CCTζ基因在家蝇幼虫受到病原微生物及热胁迫后表达量明显上调,提示MD-CCTζ基因参与了家蝇的抗胁迫过程,与家蝇幼虫抵抗外界不利环境有直接关系。
【学位授予单位】：贵阳医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R384.2
【图文】：

基因序列,生物信息学,基本性质,氨基酸组成

图2-1 BLAST中MD-CCTζ保守结构域分析Fig2-1 conserved domains analysis of MD-CCTζ in BLAST2.1.2 基本性质分析及其跨膜区、信号肽分析用 DNAman 分析软件对 MD-CCTζ 基因序列进行分析，MD-CCTζ 基因序列包含一个 1596 bp 的完整开放阅读框（ORF），包括起始密码子 ATG 和终止密码子TAG,编码一个由 531 个氨基酸组成的蛋白。利用瑞士生物信息学研究所的蛋白分析专家系统分析编码蛋白的理论等电点: 6.56 ，分子量： 58260.47Da(图 2-2）。1 ATGGCTTCAATTAGTTTATTGAATCCTAAAGCTGAATACGCTCGCGCTGCAAATGCCTTG1 M A S I S L L N P K A E Y A R A A N A L61 GCCTTTAACATCTCGGCTGCCAAAGGTTTGCAAGATGTCATGCGGACCAATTTGGGACCT21 A F N I S A A K G L Q D V M R T N L G P121 AAAGGAACAATGAAAATGTTGGTGTCGGGAGCTGGCGACATTAAAATCACCAAGGATGGT41 K G T M K M L V S G A G D I K I T K D G181 AATATTCTTTTGCATGAAATGCAAATTCAACATCCCACCGCATCGATGATTGGCCATGCT

分析结果图

MD-CCTζ蛋白的SignalP-4.1分析结果

分析结果图

MD-CCTζ蛋白的TMHMM分析结果

【参考文献】