激肽释放酶的仿生亲和纯化研究

发布时间：2020-07-14 19:56

【摘要】：激肽释放酶是丝氨酸蛋白酶家族的一员，可水解由精氨酸、赖氨酸等碱性氨基酸形成的肽键。生物体内激肽释放酶分为两类：血浆激肽释放酶和组织激肽释放酶。激肽释放酶在体内可特异性水解血浆或组织中的激肽原(或前激肽)产生缓激肽，后者则与细胞上的缓激肽B1、B2受体结合，释放第二信使cGMP、NO等来激活其他一系列的生理生化反应，如肌肉收缩、血管渗漏、嗜中性粒细胞趋化、疼痛炎症级联反应、血细胞生长等。临床的一些研究发现高血压和糖尿病的发病常伴随着体内激肽释放酶水平的降低，而激肽释放酶水平偏高可能与哮喘、关节炎等的发病有关。激肽释放酶所具有的多种生理功能，使它成为了一种重要的临床用药。目前主要用于微循坏障碍性疾病，如糖尿病引起的肾病，周围神经病，视网膜病，眼底病及缺血性脑血管病，以及高血压病的辅助治疗。近年来随着糖尿病患者的增多，对激肽释放酶的需求量也同益增加。市场上现有的激肽释放酶产品主要为猪胰激肽释放酶，也有少量为人尿激肽释放酶。尽管已有实验室报道成功构建了人组织激肽释放酶的真核表达系统和原核表达系统，但由于存在着表达量低、产物活性低等缺点，自今尚未见用作工业生产的报道。而猪胰脏因其具有来源丰富，价格低廉等优点，目前仍是临床用药的主要来源。而当前所用的纯化工艺多为离子交换法或固定化底物(approtinin)亲和层析法，存在着回收率低、使用寿命短等缺点。因此，进行激肽释放酶纯化新二工艺研究具有重要理论意义和经济意义。本实验是以脱脂的猪胰酶粗粉为原料，根据激肽释放酶的空间结构和其对底物的结合特点，以激肽释放酶的最佳底物——Phe—Arg二肽为模型，设计并合成了六种以三氮嗪为母核的小分子染料配基来对激肽释放酶进行仿生亲和纯化，并从中筛选出了一种结合力较强，特异性较高的配基——Trp介质。在将上样、沈脱条件优化(pH8，电导为3.5ms上样；pH8.5，电导10ms沈脱)后，单独使用该介质可一步从猪胰丙酮粗粉中纯化出比活性为350KU／mg的激肤释放酶样品，比原样比活提高了290倍，回收率为68%。而将该柱和 DEAE一FF一SePharose联用，所得洗脱液中激肤释放酶比活可达1 300KU/mg，比原样(丙酮粗粉)比活提高了1300多倍，回收率达63%。同时进行的介质稳定性实验、吸附容量测定、放大实验也取得了较为理想的结果。本工艺和现有其它工艺相比，具有步骤简单、回收率高、介质寿命长等优点，因此本介质及其工艺具有较强的市场应用前景。
【学位授予单位】：华中师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：Q55
【图文】：

HPLC图谱,保留时间,反相色谱,洗脱峰

.0计算第3泳道条带分子量30K0，纯度98%。协L进行反相色谱分析，详见步骤22.4.2反相色谱分析，结果见图3一11。其中样品保留时间和标准对照保留时间基本一致，HS2000分析纯度为90%，说二二)))))一一七七七七七七七006一{。。4…{0乃2刊{0习O-nu}亡、0加5加IODO15刃020D0图3一11样品HPLC图谱OEA.FF一Separose洗脱峰2的HPLC图谱(右图)，左图为激肤释放酶标准品的HPLC图谱。可石·出二者土峰保留时间均在16.smin左右，和标准品的保留时间基本一致。用HS2000软件进行纯度分析分析显示，DEAE洗脱峰2的HPLC纯度为90%。明所得的样品中除少量杂蛋白外，大部分蛋白成分为激肤释放酶。

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