分枝杆菌Ag85B的原核表达及其多克隆抗体的制备

发布时间：2020-07-15 04:40

【摘要】：一、目的 BCG膀胱灌注是治疗膀胱肿瘤防止其复发的最有效方法之一,但目前在治疗中存在着给药量大、疗效不确切、易导致结核播散等并发症,提示着必须对这一方法进行改造。Ag85B是结核杆菌的主要分泌蛋白之一,是结核杆菌的主要保护性抗原。Ag85B基因的发现为膀胱肿瘤的治疗提供了一条新的线索,利用分枝杆菌Ag85B的免疫原性,在膀胱癌及其它肿瘤治疗中的应用研究近年来受到重视。本科室正利用Ag85B基因对膀胱肿瘤的治疗进行进一步的研究,希望找到一种治疗膀胱肿瘤的新的有效方法。本实验的目的是制备兔抗Ag85B多克隆抗体, 为相关的研究提供实验室素材,用来鉴定融合蛋白内或组织里的Ag85B蛋白。 二、研究内容及结果 本研究中首先构建编码结核分枝杆菌Ag85B分泌蛋白的重组表达质粒,将此质粒转入大肠杆菌,诱导表达融合蛋白并加以纯化;然后将纯化的蛋白免疫家兔,提取家兔的抗体血清,纯化制备多克隆抗体并进行鉴定。主要研究内容和结果如下: 1.用EcoRI和SalI双酶切,从pUC18-Ag85B质粒上切下Ag85B基因片段,然后将该片段插入经过同样双酶切的融合表达载体pGEX-4T-1中,构建重组pGEX-Ag85B质粒。酶切鉴定及测序结果表明,成功构建了原核表达质粒pGEX-Ag85B; 2.将pGEX-Ag85B重组质粒转化入大肠杆菌BL21,重组基因工程大肠杆菌发酵后,用IPTG诱导表达GST-Ag85B融合蛋白,其主要是以包涵体的形式存在,洗涤包涵体进行初步纯化,将包涵体进行变性和缓慢稀释复性,用Sepharose High Performance离子柱分离纯化,SDS-PAGE电泳分析该蛋白纯度达到了95%以上; 3.将纯化的GST-Ag85B融合蛋白作为抗原,在与佐剂乳化后,免疫家兔共4次,抽取家兔的抗血清,用盐析法粗提IgG多克隆抗体,离子交换法进一步纯化抗体。酶联免疫测定法(ELISA)鉴定抗体,证明制备的多克隆抗体可以与 GST-Ag85B融合蛋白相结合,产生抗原-抗体反应。 4.利用Ag85B多克隆抗体对本科室制备的Ag85B/IL-2融合蛋白进行鉴定。 WP=9 Western-blot结果证实所制备的多克隆抗体可有效识别原核细胞表达的Ag85B/IL-2融合蛋白。 三、结论 成功制备了Ag85B多克隆抗体,初步应用效果满意,为Ag85B与膀胱肿瘤的研究提供了重要的实验室素材,为进一步的研究奠定了基础。
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R346
【图文】：

1：诱前样 4：破菌液离心上清2：诱后样 5：破菌液离心上清3：破菌液离心沉淀 6：蛋白分子量标准图 8 表达形式的考查、分离纯化1 2 3 4 5 6

【参考文献】

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本文编号：2755994