肺炎克雷伯菌荚膜糖蛋白的提取纯化及其免疫调节作用的研究

发布时间：2020-07-16 09:31

【摘要】： 肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae，Kp)荚膜糖蛋白是一种免疫调节剂，国外已开发为免疫调节药必思添(Biostim)。本文在前人工作的基础上对国内临床分离的肺炎克雷伯菌Kp-9株经过细菌裂解、抽提、去脂、去除杂蛋白和有机溶剂沉淀获得荚膜糖蛋白粗产品。经多次重复上述提取过程表明该方法有良好的重复性和稳定性。本文采用季铵盐沉淀法对粗产品进行部分纯化，分离其中的中性糖蛋白和酸性糖蛋白，最佳分离方案为：pH=7.0，样品浓度为1％，CTAB浓度为3％。对分离后的两种成分进行免疫斑点试验，表明活性成分存在于中性糖蛋白中。纯度由粗产品的29.99％提高到53.75％。继而采用制备型反相色谱法对粗产品和部分纯化产品进一步纯化，其纯度分别达到93.4％和96.3％。纯品的保留时间为4.999分钟，与必思添(保留时间5.001分钟)非常接近，其蛋白含量为33.0％、总糖24.7％、葡萄糖醛酸4.1％，与必思添报道(蛋白质30-45％，中性多糖30-40％，葡萄糖醛酸4％)基本一致，仅糖含量略偏低。本试验用高效液相色谱法测定了Kp荚膜糖蛋白的分子质量。结果必思添的保留时间为13.5分钟，分子质量55036D；本文提取的Kp荚膜糖蛋白保留时间为12.86分钟，分子质量为60634D。两者很接近，提示为同一物质。 Kp荚膜糖蛋白粗产品免疫功能检测采用淋巴细胞转化试验(MTT法)和溶血空斑试验，分别测定细胞免疫和体液免疫功能。结果4组剂量样品对T细胞增殖均有不同程度的刺激作用，以20μg/ml组刺激作用最强。溶血空斑试验用20μg/只样品免疫小鼠，结果试验组的抗体形成能力为25.667±2.965，显著高于对照组(P＜0.01)，与必思添组(20μg/只)相当(P＞0.05)。人津厂科人学硕1：学位论文本试验还观察了即荚膜糖蛋白粗产品对小鼠细菌感染的保护作用。 Kp荚膜糖蛋白分为低剂量组（3mg／k体重）和高剂量组6 体重L 免疫小队，结果大肠埃希菌组的高剂量组小鼠存活率为87．5％，与对照组（存活率12＊％）相比P叩刀5：金黄色葡萄球菌组小鼠存活率低剂量组为 87．5O，高剂量组为 100％，均显著高于对照组（前者 P＜0．05，后者 P＜0刀1人接受即荚膜糖蛋白注射的动物在观察过程中均未发现不良反应。细菌感染保护试验结束后，用ELISA法检测小鼠循环抗体效价。结果显示大肠埃希菌组中低剂量组抗体平均效价为1：443，高剂量组为 1：508；金黄色葡萄球菌组两者分别为1：408和1：487，与对照组（1：127〕相比均有显著性差异（P＜0刀1）。本试验进一步证实筛选的荚膜糖蛋白产生菌Kpg株的实用效果，并进一步确定了实验室水平制备荚膜糖蛋白的工艺条件及其体内外的免疫调节作用，为新型日服免疫调剂必思添的国产化奠定了初步基础。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2002
【分类号】：R392

【参考文献】