TAT-乙肝病毒靶向核糖核酸酶的表达纯化及其抗病毒活性的初步研究
发布时间：2020-07-16 21:30
【摘要】： 将蛋白质引入哺乳动物细胞的方法有很多，常用的有真核表达载体转染、微注射、病毒感染等等。这些方法也许在某一特定的情况下非常适用，但其都不免操作复杂，难于调控。解决办法之一就是应用蛋白转导域(Proteintransduction domain,PTD)。将PTD与蛋白质、多肽或DNA等分子共价连接或与目的基因融合表达后，PTD可将这些分子以一种不依赖受体和转运蛋白的方式导入细胞。来源于HIV的TatPTD就是一种转导能力很强的蛋白转导域(本研究中简称TAT)。实验证明TAT融合蛋白可导入小鼠体内的所有组织和细胞，甚至可以通过血脑屏障。因此，TAT蛋白转导系统被认为是一种很有前途的运载工具，无论对于基础研究还是临床治疗，都有着非常广泛的应用前景。 为了探索应用PTD将乙肝病毒靶向核糖核酸酶导入人体治疗乙型肝炎的可行性，本研究中首先将乙肝病毒靶向核糖核酸酶(HBV targetedribonuclease,TR)基因及其对照—突变失活的乙肝病毒靶向核糖核酸酶(mutant targeted ribonuclease,TRmut)基因、乙肝病毒核心蛋白(HBV coreprotein,HBVc)基因、人嗜酸性粒细胞来源的神经毒素(human eosinophil derived neurotoxin,hEDN)基因，分别克隆入含有蛋白转导域TAT的pTAT-HA原核表达载体。在大肠杆菌BL21(DE3)LysS内，以IPTG诱导融合蛋白表达，表达产物用SDS-PAGE及Western blot分析鉴定。优化表达条件后大量 第四军医大学硕士学位论文 中文摘要 表达，在变性条件下以 Ni－NTA仓grose和 PD八 脱盐柱进行纯化。纯化产物 的浓度及纯度分析表明，成功地纯化了四种TAT融合蛋白。以构建的PET30a （＋）／TR、pET30a（＋）／TRmut及pET30a（＋）／HBVc转化大肠杆菌BLZI （DE3）LySS，相同方法表达并纯化不含TAT的对照蛋白。将四种TAT融合 蛋白及其对照分别加入培养的2．2．15细胞上清中，利用间接免疫荧光法检测 TAT融合蛋白的跨膜转导效率发现：经TAT融合蛋白处理的细胞，胞浆中均 出现较强的绿色荧光；而经不含TAT的对照蛋白处理的细胞则没有荧光出现。 这一结果显示制备的TAT融合蛋白可以高效的导入2．2二5细胞。我们采用固 相放免法检测TATTR的抗病毒活性发现：与MOCK组相比加有TATTR的 实验组细胞上清中 HBeAg的浓度下降了 60．3％；而TRmut、hEDN和 HBVc 组细胞上清中的HBeAg浓度与MOCK组的差异无统计学意义，说明制备的 TATTR具有较好的抗病毒活性。MTT检测结果显示TATTR并不影响细胞 的生长及代谢。由此我们得出结论：TAT乙肝病毒靶向核糖核酸酶融合蛋白 的制备及其抗病毒作用的初步研究，为应用靶向核糖核酸酶治疗乙肝病毒感 染奠定了基础。
【学位授予单位】：中国人民解放军第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2003
【分类号】：R341
【图文】：
四军医大学硕士学位论文研究内容一聚合酶分子132，33]。在大肠杆菌、酵母和哺乳动物细胞中表达HBvC基因，可以得到27tun的核心颗粒，表明HBVc不需任何其他蛋白的参与即可自装配成核心颗粒洲。HBv。梭基端的38个氨基酸组成4个富含精氨酸残基Arg)的区域，用胰蛋白酶除去竣基端的这些区域后，HBVc丧失与RNA结合活性。在大肠杆菌中表达删除梭基端编码区的HBV。基因，表达产物能形成颗粒，但其中不再含有RNA，表明装配核心颗粒所需的序列位于蛋的前153个氨基酸，而梭基末端富含精氨酸残基的区域则含有RNA结合装配的信号[35一38]。所以，选择核心蛋白作为靶向分子可使融合蛋白更容易合到HBVpgRNA上，更好地发挥核糖核酸酶降解RNA的作用。(图6)寡嘴息T获人T匆O拟O少一
AGE分析Bvc转化的BLZI;2:p丁AT-HA/hEDN转化化的BL21;5:pl’A1飞HA/TR转化的BLZI;6:plEanalysisofrAI，fusionProteinsrmedbyPTAI下HA旧BVe:2:Eeolitransfor4:E.colitransformedbyPl’AT-HA:5:E，eolitrarmedbyPTAT-HA/TRlnut向核糖核酸酶融合蛋白的Weste步明确1丫d飞革巴向核糖核酸酶在大肠血清进行了免疫印迹分析，结果如图8显的条带，而两个阴性对照均未出现‘rl卜TR的Westernblot分析导加鼠免疫血清;2:未诱导对照;3:血清对照;4:低分子蛋白标准
图12重组质粒的酶切鉴定1:PE下30a(+):2:PET-30a(+)/TR(勒刀oNA标志物(DL200o，2000，1000，750，5由上向下);4:pE不3oa(+)/HBve(KPnl/去Fig.12RestrictionenzymesdigesreC0mbinslltSI:PET-30a(+):2:PET-3Oa(+)/TR(KPnDNAMarkers(2000，1000，750，500，250，tobottom);4:pE不30a(+)/HBVc(舜脚I/纯化的SDS~PAGE分析R、pET-30a(+)/TRlnut及PE下3Oa(+)/HBVeLysS后，表达并纯化不含护D妞，的对照蛋)，SDS一PAGE分析的结果显示对照蛋白纯1031234567.5
本文编号：2758535
【学位授予单位】：中国人民解放军第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2003
【分类号】：R341
【图文】：
四军医大学硕士学位论文研究内容一聚合酶分子132，33]。在大肠杆菌、酵母和哺乳动物细胞中表达HBvC基因，可以得到27tun的核心颗粒，表明HBVc不需任何其他蛋白的参与即可自装配成核心颗粒洲。HBv。梭基端的38个氨基酸组成4个富含精氨酸残基Arg)的区域，用胰蛋白酶除去竣基端的这些区域后，HBVc丧失与RNA结合活性。在大肠杆菌中表达删除梭基端编码区的HBV。基因，表达产物能形成颗粒，但其中不再含有RNA，表明装配核心颗粒所需的序列位于蛋的前153个氨基酸，而梭基末端富含精氨酸残基的区域则含有RNA结合装配的信号[35一38]。所以，选择核心蛋白作为靶向分子可使融合蛋白更容易合到HBVpgRNA上，更好地发挥核糖核酸酶降解RNA的作用。(图6)寡嘴息T获人T匆O拟O少一
AGE分析Bvc转化的BLZI;2:p丁AT-HA/hEDN转化化的BL21;5:pl’A1飞HA/TR转化的BLZI;6:plEanalysisofrAI，fusionProteinsrmedbyPTAI下HA旧BVe:2:Eeolitransfor4:E.colitransformedbyPl’AT-HA:5:E，eolitrarmedbyPTAT-HA/TRlnut向核糖核酸酶融合蛋白的Weste步明确1丫d飞革巴向核糖核酸酶在大肠血清进行了免疫印迹分析，结果如图8显的条带，而两个阴性对照均未出现‘rl卜TR的Westernblot分析导加鼠免疫血清;2:未诱导对照;3:血清对照;4:低分子蛋白标准
图12重组质粒的酶切鉴定1:PE下30a(+):2:PET-30a(+)/TR(勒刀oNA标志物(DL200o，2000，1000，750，5由上向下);4:pE不3oa(+)/HBve(KPnl/去Fig.12RestrictionenzymesdigesreC0mbinslltSI:PET-30a(+):2:PET-3Oa(+)/TR(KPnDNAMarkers(2000，1000，750，500，250，tobottom);4:pE不30a(+)/HBVc(舜脚I/纯化的SDS~PAGE分析R、pET-30a(+)/TRlnut及PE下3Oa(+)/HBVeLysS后，表达并纯化不含护D妞，的对照蛋)，SDS一PAGE分析的结果显示对照蛋白纯1031234567.5
【引证文献】
相关博士学位论文 前1条
1 陈鸿军;MDV CVI988弱毒疫苗株VP22蛋白转导功能研究[D];扬州大学;2006年
本文编号：2758535
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/binglixuelunwen/2758535.html
最近更新
教材专著
