不同方法制备富血小板纤维蛋白对脂肪干细胞体外增殖影响的实验研究
本文关键词：不同方法制备富血小板纤维蛋白对脂肪干细胞体外增殖影响的实验研究，由笔耕文化传播整理发布。
【摘要】：目的:旨在通过不同离心速度及离心时间制备富血小板纤维蛋白(platelet-rich fibrin,PRF),比较其内所含生长因子特别是血小板衍生生长因子-AB(Platelet-derived growth factor,PDGF-AB)和转化生长因子-β1(Transforming growth factor-beta1,TGF-β1)含量及其对脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)体外增殖的情况,为将制备出优良的PRF应用于软组织创面修复提供实验依据。方法:取新西兰大耳白兔腹股沟部脂肪组织,使用胶原酶消化法处理脂肪组织,培养原代脂肪干细胞,观察细胞形态及变化,通过血球计数板于倒置显微镜下计数并绘制细胞生长曲线图,收集第3代细胞进行体外三系诱导分化,在诱导7天、14天、28天时间里,分别加入成脂诱导液培养基后行油红O染色、成骨诱导液培养基后行Von Kossa染色、成神经诱导液培养基后行免疫细胞荧光检测,鉴定ADSCs多向分化潜能;取新西兰大耳白兔自体静脉血,分别以不同速度(2700 r/min、3000 r/min、3300 r/min)、不同时间(10min、15 min、20 min)离心制备PRF,通过ELISA试剂盒对每个PRF在静置7天、14天、21天时间里,释放液中TGF-β1和PDGF含量进行检测,观察各组生长因子的浓度差异;CCK-8比色法检测不同方法制备的PRF对ADSCs细胞体外增殖活性的影响。结果:原代培养脂肪干细胞呈成纤维细胞样贴壁生长,具有很强的增殖能力,并成功向成神经元细胞、骨组织细胞和脂肪细胞诱导分化,即具有干细胞特性,因而所培养的细胞为脂肪来源干细胞(ADSCs)。同一静置时间下,以2700 r/min,15 min组制备的PRF释放PDGF-AB、TGF-β1的含量显著高于10 min组及20 min组;以3000 r/min,10min组制备的PRF释放PDGF-AB、TGF-β1的含量显著高于15 min组及20 min组;且2700 r/min,15min组制备的PRF释放PDGF-AB、TGF-β1的含量显著高于3000 r/min,10 min组(P㩳0.05);以3300 r/min组的离心速度下,不同离心时间制备的PRF释放PDGF-AB、TGF-β1的含量无统计学意义(P㧐0.05)。CCK-8比色法检测2700r/min,15 min组制备的PRF对ADSCs增殖的OD值高于3000 r/min及3300 r/min组(P0.05)。结论:来源于动物脂肪吸收物通过胶原酶消化、分离、原代培养的方法可获得大量的具有干细胞特性的ADSCs;通过精确的方法制备PRF更能促进脂肪干细胞体外增殖,有望将制备优良的PRF应用于皮肤软组织缺损创面修复。
【关键词】：富血小板纤维蛋白 脂肪来源干细胞 离心方法
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R329.2
【目录】：
- 摘要3-5
- ABSTRACT5-10
- 英文缩略词表10-11
- 第1章 引言11-14
- 1.1 研究背景11
- 1.2 富血小板纤维蛋白11-13
- 1.2.1 血小板衍生生长因子12
- 1.2.2 转化生长因子12
- 1.2.3 血管内皮生长因子12-13
- 1.2.4 胰岛素样生长因子13
- 1.3 本研究思路13-14
- 第2章 兔ADSCs的原代和传代培养14-20
- 2.1 材料14-15
- 2.1.1 实验动物及组织来源14
- 2.1.2 主要实验试剂14
- 2.1.3 主要仪器14-15
- 2.2 方法15-17
- 2.2.1 主要试剂的配制方法15
- 2.2.2 ADSCs原代培养并传代15-16
- 2.2.3 ADSCs传代培养16
- 2.2.4 细胞冻存16-17
- 2.2.5 细胞复苏17
- 2.3 结果17-18
- 2.3.1 原代及传代ADSCs的形态学特征17
- 2.3.2 细胞计数及绘制第3代ADSCs生长曲线17-18
- 2.4 结论18-20
- 第3章 兔脂肪干细胞鉴定20-23
- 3.1 材料20
- 3.2 脂肪干细胞多向诱导分化鉴定20-22
- 3.2.1 成脂诱导和油红O染色20-21
- 3.2.2 成骨诱导和Von Kossa染色21
- 3.2.3 成神经诱导和免疫细胞化学荧光21-22
- 3.3 结果22
- 3.3.1 成脂诱导后观察22
- 3.3.2 成骨诱导后观察22
- 3.3.3 成神经诱导后观察22
- 3.4 结论22-23
- 第4章 PRF制备及其对ADSCs增殖情况23-30
- 4.1 材料23
- 4.1.1 主要试剂23
- 4.1.2 主要仪器23
- 4.2 方法23-24
- 4.2.1 不同离心方法制备PRF膜片23-24
- 4.2.2 不同实验组离心后PRF生长因子含量比较24
- 4.2.3 CCK-8 比色法检测各组细胞增殖比较情况24
- 4.2.4 统计学方法24
- 4.3 结果24-29
- 4.3.1 自体富血小板纤维蛋白的性状24-25
- 4.3.2 不同离心方法制备PRF膜释放生长因子含量的比较25-28
- 4.3.3 CCK-8 比色法检测各组细胞增殖情况（OD值）28-29
- 4.4 结论29-30
- 第5章 讨论30-34
- 5.1 PRF的形成与结构30-31
- 5.2 PRF制备与生长因子的关系31-32
- 5.3 PRF膜体外释放PDGF-AB、TGF-β132
- 5.4 PRF生物特性及促ADSCS体外生长32-34
- 第6章 全文总结与展望34-35
- 6.1 全文总结34
- 6.2 展望34-35
- 致谢35-36
- 参考文献36-39
- 附图39-41
- 攻读学位期间的研究成果41-42
- 综述42-49
- 参考文献46-49
【参考文献】
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