脉肿电磁场对人骨髓间充质干细胞增殖与成骨分化的影响

发布时间：2020-07-18 15:15

【摘要】：各种原因所致的骨缺损在临床上十分常见,骨修复材料需求量巨大,而无论是自体骨,还是人工替代材料都有其固有缺陷,不能满足临床的需要,应用组织工程技术有希望为骨缺损治疗制备充足的理想骨修复材料,并展示了良好的临床应用前景。骨髓间充质干细胞 (Mesenchymal Stem Cells)具有良好的成骨细胞分化潜能和成骨活性,被认为是骨组织工程种子细胞的最佳选择之一,而如何快速足量地获取高质量的种子细胞以及如何定向诱导其成骨分化是骨组织工程学实验研究的关键。 脉冲电磁场(pulsed electromagnetic fields, PEMFs)临床用于治疗骨不连、骨延迟愈合、假关节取得成功,以及特定频率,特定场强PEMFs能够刺激成骨细胞增殖、分化,并可刺激骨局部因子的产生,加速骨基质矿化亦已被国内外学者们证实。然而有关PEMFs对MSCs成骨的具体生物学作用研究尚未见报道,而骨髓MSCs是骨修复中形成骨的重要前祖细胞之一,因此我们推测PEMFs刺激很可能对 hMSCs产生一系列生物学作用,并促进骨形成。本课题观察脉冲电磁场刺激hMSCs体外增殖的作用以及诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的能力,为临床上体外快速获取高质量hMSCs来源的骨组织工程种子细胞提供新的技术手段。研究主要获得以下结果: 一、研究脉冲电磁场对人骨髓充质干细胞增殖及细胞周期的影响。将传代的第三代hMSCs分为四组:1.常规传代培养液组(以下简称P-I-); 2.常规传代培养液施加脉冲电磁场组(12Hz, 1.1mT, 8h/d) (以下简称P+I-); 3.化学诱导剂(地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素C)联合常规传代培养液组(以下简称P-I+); 4.化学诱导联合脉冲电磁场(以下简称P+I+),应用四氮噻唑盐(MTT)比色法检测细胞的增殖,绘制细胞生长曲线,计算细胞倍增时间,应用流式细胞仪检测细胞周期情况。结果:化学诱导培养液组细胞增殖较常规传代培养液组慢,而脉冲电磁场作用后的细胞增殖能力得到提高,PEMFs刺激后的hMSCs实验组生长曲线较对照组前移,P-I-组细胞倍增时间为33.6h,P+I-组细胞倍增时间为29.4h,P-I+组细胞倍增时间为36.2h, P+I+组细胞倍增时间为34.8h; PEMFs连续刺激5d后流式细胞仪检测细胞周期:P+I-组细胞S期细胞百分比 (20.15 基金项目:国家863计划重大专项(2003AA205002);重庆市重点科技攻关基金资助项目(2003-13-6)。 WP=9 ±2.10) %,同期P-I-组细胞S期细胞百分比(8.56±1.13)%,P-I+组细胞S期细胞百分比(5.91±0.43)%,P+I+组细胞S期细胞百分比(7.73±0.96)%。上述结果提示PEMFs对hMSCs的生物学效应一个重要方面表现在PEMFs能够显著促进hMSCs细胞增殖,DNA合成加速(p0.01)。 二、观察脉冲电磁场诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响。将传代的第三代hMSCs予以常规传代培养液培养,施加脉冲电磁场(12Hz, 1.1mT, 8h/d),应用倒置显微镜观察细胞形态,透射电镜观察细胞超微结构、碱性磷酸酶染色、骨钙素免疫组化染色、Ⅰ型胶原免疫组化染色、核固红钙染色、Von Kossa钙染色、四环素荧光标记以及放免法测定骨钙素的分泌情况和碱性磷酸酶(ALP)活性的测定。结果:经PEMFs刺激4d～ 5d后, hMSCs细胞形态发生变化,2 周形成多层结构 ,3周左右聚集成细胞钙化结节。透射电镜观察提示:细胞成熟,核浆比例小,内质网扩张,细胞碱性磷酸酶染色、骨钙素免疫组化染色、Ⅰ型胶原免疫组化染色、核固红钙染色、Von Kossa钙染色、四环素荧光标记均阳性。而常规传代培养液组hMSCs随培养时间延长并未出现细胞钙化结节,同期透射电镜观察提示为幼稚细胞,核浆比例大,细胞碱性磷酸酶染色、骨钙素免疫组化染色、Ⅰ型胶原免疫组化染色均阴性;PEMFs刺激hMSCs后能够诱导细胞的骨钙素分泌,随刺激时间延长,骨钙素活性增高更加明显,而常规传代培养液组hMSCs未检测到骨钙素的分泌,同样PEMFs刺激组hMSCs的ALP活性亦显著增高,刺激4天后即可见ALP显著增高,随刺激时间延长,ALP活性增高更加明显,12天达到高峰,14天时略有下降,仍高于对照组水平。ALP活性第6天所测结果为;P+I-组为0.42±0.02金氏单位/100ml,P-I+组为0.47±0.03金氏单位/100ml,P+I+组为1.12±0.11金氏单位/100ml,而P-I-组仅为0.02±0.01金氏单位/100ml,上述结果提示:人骨髓间充质干细胞经合理的脉冲电磁场体外刺激后,能够明显促进hMSCs成骨分化(p0.01),符合成骨细胞的形态特征和生物学特性,可为体外构建组织工程化骨提供自体种子细胞。 综上所述,我们可以得出结论:脉冲电磁场能够促进其增殖,缩短细胞倍增时间,生长曲线前移;脉冲电磁场能够诱导其向成骨细胞分化,表达碱性磷酸酶、骨钙素、Ⅰ型胶原,促进其骨矿化,适合作为骨组织工程的种子细胞。
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R329.2
【图文】：

051015202530S G2+M+S细胞周期分率（％）百P-I-P+I-P-I+P+I+第三代 hMSCs 在 P-I-、P+I-、P-I+、P+I+培养条件下第 5d 所测细胞周期

流式细胞仪检测第三代hMSCs在P＋I－培养条件下的第5d细胞周期

流式细胞仪检测第三代hMSCs在P－I＋培养条件下的第5d细胞周期

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本文编号：2761064