结核分支杆菌Ag85A、Ag85B DNA疫苗的构建、免疫原性及其保护效力的研究

发布时间：2020-07-18 03:14

【摘要】：目的：构建结核分支杆菌分泌蛋白Ag85A、Ag85B编码基因的DNA疫苗，研究这两种DNA疫苗的免疫原性和保护效力。方法：用PCR的方法扩增结核分支杆菌Ag85A、Ag85B编码基因，然后与真核表达载体pVAX1重组，构建的DNA疫苗经PCR、酶切和测序鉴定后，应用Qiagen试剂盒大量纯化无内毒素的质粒DNA。将C57BL／6小鼠随机分为5组，每组10只，分别用生理盐水(A)、载体质粒(B)、Ag85A DNA疫苗(D)、Ag85B DNA疫苗(E)通过肌肉注射的方法免疫小鼠，每3周免疫1次，共免疫3次；卡介苗(C)组每只小鼠腹部皮内注射，只免疫一次。通过ELISA方法检测血清中抗Ag85A、Ag85B抗体及其亚型。上述5组小鼠各取6只，第三次免疫后28天用结核分支杆菌H37Rv攻击，观察小鼠体重变化，攻击4周后检测细胞因子IFN-γ、IL-12，进行肺组织病理检查及菌落计数等。结果：重组质粒Ag85A-pVAX1和Ag85B-pVAX1 DNA经PCR扩增分别可见1041bp Ag85A和978bp Ag85B特异性片段；经限制性内切酶Nhe Ⅰ和BamH Ⅰ消化后也可见1041bp或978bp特异性片段；测序结果也表明成功地构建了Ag85A和Ag85B DNA疫苗。经Ag85A和Ag85B DNA疫苗免疫的小鼠特异性抗体IgG均显著高于对照组，而且IgG2b均高于IgG1和IgG2a。结核分支杆菌攻击后各组小鼠体重变化呈现不同趋势，A、B组小鼠体重从第3周开始下降；C组体重除第3周较前一周略有下降外，总体呈上升趋势；D组在第4周开始下降；E组体重第2周开始下降，之后维持不变。MTT法检测脾淋巴细胞增殖实验中D、E组的刺激指数显著高于其它组；D、E组小鼠脾淋巴细胞转化率也显著高于A、B组。肺组织菌落计数C组最低，其次是E、D组。大体病理结果显示C组和D组肺组织病变较A、B、E组轻。A和E组中各有2只，B组中有3只肺部有病变，充血较明显，组织有捻发感。小鼠肺组织切片镜下观察显示：A组小鼠约70～80％的肺泡腔内有大量渗出液，肺泡壁充血、水肿，小血管周围有少量淋巴细胞浸润，未见典型肉芽肿形成。B组肺泡壁肿胀、增厚、有少量淋巴细胞聚集，少数肺泡腔内充满渗出液，部分肺泡腔消失，未见典型肉芽肿形成。C组肺泡壁增厚，可见大量淋巴细胞聚集，并有肉芽肿形成，导致部分肺泡腔消失，肺泡腔内无明显渗出液。 D组肺泡壁增厚，可见淋巴细胞聚集和肉芽肿形成，与C组类似，但肉芽肿数目比C组少，表现为增殖为主的病变。E组肺泡壁充血、增厚，部分肺泡腔萎陷，肺泡腔内渗出液不明显，可见少量淋巴细胞浸润，未见典型肉芽肿形成。各组小鼠未见干酪样坏死。结论:Ag85A、Ag85B DNA疫苗都具有较强的免疫原性，呈THI型细胞介导的免疫应答; Ag85A DNA疫苗的免疫保护效力比Ag85B DNA疫苗强，但均不如 BCG，有待进一步研究其应用价值。
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2003
【分类号】：R392
【图文】：

电泳图,电泳图,质粒,样品

用Qiagen试剂盒大量提取载体质粒和重组质粒Ag85A、Ag85B，纯化过程中留取的洗脱液样品经0.8%琼脂糖凝胶电泳显示，纯化的DNA样品无RNA污染(见图3)每次制备的DNA样品经紫外分光光度计测定OD260n耐OD280nm均为1.8左右(见图4，5，6)DNA纯度高，不含RNA和蛋白。以生理盐水注射液调整三种质粒DNA浓度为lm留ml。

【共引文献】