红系转录因子FKLF的表达纯化及初步研究

发布时间：2020-07-23 03:30

【摘要】：珠蛋白基因的程序性表达是组织发育时期专一性的。人的5个β类珠蛋白基因在11号染色体的短臂上形成一簇(ε，~Aγ，~Gγ，δ和β)，并且它们的表达有两个主要的开关，一是从胚胎型(ε)到胎儿型(γ)基因表达，接着是由胎儿型(γ)到成人型(β)珠蛋白基因表达。尽管人们已鉴定出许多珠蛋白基因的顺式调控元件及相应的反式作用因子，但珠蛋白基因调控的精确分子机制仍不甚明了，尤其对涉及胎儿及胚胎珠蛋白基因发育控制的反式作用因子所知有限。在参与β-类珠蛋白基因调控的反式作用因子中，具有Cys2-His2型锌指的Kr(?)ppel样因子目前研究的较多。其中，人们已经对Spl——通用Kr(?)ppel类锌指蛋白，及EKLF——系组织专一的Kr(?)ppel类锌指蛋白进行了很好的研究。已知Spl与ε、γ及β-珠蛋白基因启动子CACCC box相互作用；EKLF对β-珠蛋白基因的表达至关重要，它结合在β-珠蛋白基因启动子的CACCC box上。近两年来，又有FKLF和FKLF-2两个新Kr(?)ppel样因子相继被鉴定出来。根据现有的研究，我们知道FKLF主要由512个氨基酸组成，在近羧基末端有3个邻近的锌指，它与Spl、EKLF及KLF家族其他蛋白的锌指结构相同。根据锌指的氨基酸同源性，FKLF属于Kr(?)ppel样因子的第三个亚族。FKLF的特点是在长的氨基末端区含有两个酸性及两个富含脯氨酸的区域。FKLF主要的转录活性在氨基端，氨基端的两个酸性区构成了FKLF反式激活功能的关键区域。FKLF主要在红系细胞中表达，可能是体内胚胎型及胎儿型珠蛋白基因表达的一个激活因子。目前，国内外还没有对FKLF原核表达及纯化的研究。本论文通过用PCR方法从pBS/FKLF质粒中扩增得到FKLF的编码序列，将其克隆到原核表达载体pET32a(+)上，转化E.coli BL21(DE3)后用IPTG诱导，获得了FKLF融合蛋白的高表达。再将收集到的包涵体进行8％聚丙烯酰胺凝胶电泳，从胶中分离纯化获得较纯的FKLF融合蛋白，经纯化浓缩后的蛋白浓度约为3.5mg/L培养基。再将获得的FKLF蛋白免疫新西兰大耳兔及Balb/C小鼠，制备了FKLF多克隆抗体，效价为1∶800。同时，我们还构建了FKLF的真核表达质粒pIRES-EGFP/FKLF、pcDNA3/FKLF和pIRES-pac/FKLF。实验结果表明，在转染有这三个表达质粒的华东师范大学硕士学位论文 K562细胞中，FKLF的表达均比空白对照及空载体对照增加明显。这为进一步研究FKLF对胚胎及胎儿珠蛋白基因表达的影响奠定了基础，同时也为进一步获得稳定表达的细胞株奠定了基础。另外，我们还以K562细胞和HEL细胞为模型研究了轻基脉这一胎儿型珠蛋白的诱导剂对内源FKLF表达的影响。结果显示，轻基脉不能在转录水平上增加内源FKLF的表达，而且用FKLF的抗体在翻译水平上也没能检测到FKLF的表达。我们推测可能有其它被激活的转录因子影响了FKLF的表达。
【学位授予单位】：华东师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：Q785
【图文】：

表达质粒,限制酶切分析,重组质粒

重组质粒的限制酶切分析

重组表达质粒,体表,染色体,菌体

达L21(DE3)的染色体上整合了T7RNA聚合酶，在IPTG的诱导下可以高效转录克表达条件试验中，将重组表达质粒pETeoli.BL21(DE3)，同时进行IpTG诱导。从，FKLF的表达并无明显差异，所以我们5中可以看出，在空载体组及未用IPTG在含有重组质粒的菌体经1mMIPTG诱达到最高。经SDS一队GE分析，pET32a(量(一80kD)一致，而空载体表达菌则2345

诱导时间,蛋白,分离纯化,包涵体

图5.FKLF诱导时间的确定.5.DetenninationoftheinduetiontimeofFK1(DE3产KLF总菌蛋白;2~5为分别经lmMIP分子量蛋白标准;6:经1mMIPTG诱导sh的空性分析n1MIPTG诱导4h后，表达产物FKLF淀中，而不存在于裂解上清中(见图6)。包涵体中，进一步的分离纯化只须收集包2秘瞬麟彝寒

【参考文献】