KGF-2、bFGF核转位机制的初步探讨

发布时间：2020-07-24 00:46

【摘要】：KGF-2、bFGF核转位机制的初步探讨 KGF-2和bFGF同属成纤维细胞生长因子家族，它们都是多效能的细胞因子，在许多重要的生理过程中发挥作用。这些过程包括细胞分化、增殖、血管生成、肿瘤发生、损伤修复、胚胎发育等。目前关于它们发挥作用的分子机制还不是十分清楚，我们根据分子生物学原理，结合基因重组、酵母双杂交、哺乳动物细胞双杂交、细胞培养等方法对KGF-2和bFGF相互作用蛋白进行了初步研究。研究结果可概述为以下几个方面： 一、采用PCR方法，从人胎肝cDNA文库中成功钓取了KGF-2和bFGF基因。 二、利用酵母双杂交系统2筛选KGF-2和bFGF的相互作用蛋白。构建KGF-2和bFGF的诱饵蛋白载体pAS2-1-KGF-2和pAS2-1-bFGF并分别转化至酵母宿主Y190，对KGF-2和bFGF自身的转录激活活性进行了分析，结果表明KGF-2和bFGF自身不具有转录激活活性。通过对胎肝cDNA文库的筛选，得到了2个与KGF-2存在相互作用的蛋白。序列分析和同源检索表明：它们分别为未知蛋白PR02605和人核糖体蛋白L22(RPL22)。文献检索显示它们都是新发现的可能和KGF-2发生相互作用的蛋白质。目前对RPL22了解较多，它含有三个结构域，分别是N-结构域、I-结构域和C-结构域，在RPL22的N端有一个经典的核定位信号。KGF-2与RPL22之间的相互作用可能是其进入细胞核的途径之一。 三、利用哺乳动物细胞双杂交系统在COS-7细胞内验证了KGF-2与人核糖体蛋白L22间的相互作用。 四、利用外源性KGF-2和bFGF刺激NIH／3T3细胞，观察人核糖体蛋白L22基因表达的变化。结果显示，KGF-2和bFGF作用于细胞后使RPL22基因表达水平升高。
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：Q78
【图文】：

OO2.1#阳性AD质粒3.2#阳2个阳性AD质粒心了H酶切2阳性对照3一4阴性对照1#阳性质粒与pASZ一1一KGF一2共2#阳性质粒与pASZ一l一KGF一2共阳性质粒单转82#阳性质粒单51#、2#阳性质粒的转录激活

本实验利用哺乳动物细胞双杂交系统(Malnlnal1anMATCHMAKERTwo一HybridAssay)和薄层色谱法(Thin一Layerehromatography)在eOS一7细胞中进一步验证KGF一2与候选蛋白之间的相互作用。其基本原理为(图18):哺乳动物细胞双杂交的BD、AD质粒分别为pM和pVP16，pM编码GAL4DNA一BD结构域，pVP一6编码VP16(单纯疤疹病毒VP16蛋白)AD结构域;将KGF一2基因克隆至GAL4BD下游，A.如蛋白质X和Y相互作用可激活报告基因表达B.如蛋白质X和Y不发生相互作用激活报告基因不表达图18哺乳动物细胞双杂交原理示意图

00DNAMarker2PVP16一l#316一l#，pvP16一2#凡冰I和石妞肠H分析薄层色谱结果本原理为:如果诱饵蛋白与候选蛋AD彼此靠近而激活报告基因CA入乙酞CoA和氯霉素，在氯霉素氯霉素。采用薄层色谱即可检测到43

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本文编号：2768061