基于P64K蛋白的胃泌素G17治疗性疫苗的研究

发布时间：2020-08-05 06:38

【摘要】：胃泌素(gastrin，GAS)是胃窦和十二指肠粘膜G细胞分泌的多肽类激素，主要生理作用是促进胃酸分泌和胃肠道粘膜的生长。研究显示胃泌素是胃肠道肿瘤自泌性的生长因子，通过促进肿瘤细胞增殖、抑制凋亡、刺激浸润以及和COX-2协同作用促进肿瘤生长。胃肠道肿瘤的抗胃泌素治疗分为分泌抑制、受体拮抗、反义寡核苷酸抑制和抗胃泌素抗体治疗。本课题的目的是开发一种基于脑膜炎球菌P64K蛋白的针对胃肠道肿瘤的胃泌素G17治疗性疫曲。我们选用人胃泌素G17N端9个氨基酸的B细胞表位(Glu-Gly-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu)作为靶位，这个表位为胃泌素G17和甘氨酸延伸型胃泌素G17所特有，因而产生的抗胃泌素G17抗体不会与G34和CCK发生交叉反应。 P64K蛋白是来自于脑膜炎奈瑟氏球菌的一种外层膜蛋白。P64K蛋白作为载体蛋白可以帮助激活特异性体液免疫反应，近年来研究显示P64K较传统载体蛋白BSA、TT等有更好的免疫增强效果。我们选择P64K蛋白，通过一段多肽交联桥(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)与G17的B细胞表位交联或者是构建G17P64K融合蛋白来作为治疗性疫苗，诱导机体产生抗胃泌素G17的抗体从而中和并清除内分泌或者是源自肿瘤细胞自分泌的胃泌素，达到治疗胃肠道肿瘤的目的。我们从脑膜炎球菌中通过PCR克隆得到了P64K基因，构建了P64K基因和G17P64K基因的pET28a表达载体，并在大肠杆菌中得到了高表达。目的蛋白经硫酸铵沉淀、疏水层析、分子筛层析和阴离子层析得到纯度超过90％的样品。FMOC同相法化学合成多肽pyro-Glu-Gly-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Cys。MBS法交联多肽与载体蛋白P64K及DT。制备抗胃泌素G17抗体试验分为5组：合成多肽组，P64K蛋白组，DT多肽交联组、P64K多肽交联组和G17P64K融合蛋白组，分别加氟氏佐剂后免疫兔。经两次加强免疫后在DT多肽交联组和P64K多肽交联组动物血清中产生了高滴度的抗胃泌素G17抗体。细胞水平的体外活性评价试验显示抗体有较好的抑制肿瘤生长的生物学活性。
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R392.1
【图文】：

胃泌素,翻译后加工,成熟过程

G细胞转录产生唯一的长度为0.7kb的胃泌素mRNA，在粗面内质网中翻译生成101个氨基酸残基的前胃泌素原(Preprogastrin)[3]。前胃泌素原经不同方式的剪接产生多种结构形式的胃泌素分子(见图1)。前胃泌素原切除N端21个氨基酸长的信号肤，生成胃泌素原(progastrin)而被转运到高尔基体。在高尔基体内，胃泌素原第86位酪氨酸残基(Tyr86)被硫酸化，第%位丝氨酸残基(Ser96)被磷酸化修饰后，由高尔基体囊泡运输到G细胞基底的早期内分泌颗粒内。运输过程中，在胰蛋白酶、类梭基肤酶E的作用下，胃泌素原被降解生成甘氨酸延仲型胃泌素34。甘氨酸延伸型胃泌素34的N末端进一步被蛋白酶剪切加工，再经谷氨酞环化修饰后进入内分泌颗粒。在内分泌颗粒内

产物鉴定,基因扩增,脑膜炎

素G17治疗性疫苗的研究第四章实验结果的克隆因的克隆方法3.1.1内引物1、2为上下游引物，以脑膜炎CR扩增尸64K基因，经1%琼脂糖凝胶电泳分析显图5所示条带大小与预测结果一致。

产物鉴定,基因扩增

方法311内引物12为上下游引物，以脑膜炎CR扩增尸64K基因，经1%琼脂糖凝胶电泳分析显图5所示条带大小与预测结果一致。图5P64K基因扩增产物鉴定图潜止密码子的P64K’基因的克隆方法3.1.2内引物1、3为上下游引物，PCR循环条电泳分析显示条带大小与预测结果一致(图6)。

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