沙眼衣原体J型野生株ompA基因重组子的构建

发布时间：2020-08-05 13:00

【摘要】：衣原体是专性细胞内寄生的原核微生物，革兰氏染色阴性，属细菌范畴。衣原体引起的疾病相当广泛：在发达国家衣原体是性传播疾病的首位病原体，由它引起的非淋菌性尿道炎的发病率超过淋病，在性传播疾病中己跃居首位；沙眼衣原体(C．t)感染眼部引起的沙眼曾肆虐全世界，至今仍是全球可预防性眼盲的首要原因；衣原体感染动物可导致牛、羊流产，母鸡不能正常产卵，对养殖畜牧业造成很大危害；因此衣原体越来越成为人们关注的重要病原体。人们急切地期待衣原体疫苗的出现以控制衣原体的感染及蔓延，科技工作者在此领域已探索50余年，曾试验过多种疫苗，如：灭活或减毒的衣原体疫苗、亚单位疫苗、树突状细胞疫苗等，但迄今尚无成熟疫苗问世。近年来DNA疫苗研究的快速发展给衣原体疫苗研制带来新的希望，随着分子生物学技术突飞猛进的发展，基因工程技术日臻完善，衣原体的生物构成及基因序列日益明朗，衣原体的DNA疫苗很有发展潜力。 DNA疫苗是运用基因工程技术，将编码某种蛋白的外源基因与细菌质粒构建的重组体直接免疫机体，转染宿主细胞，使其表达保护性抗原，从而诱导机体产生特异性免疫的疫苗。本实验的目的是构建C．t主要外膜蛋白(MOMP)编码基因ompA与pcDNA3质粒的重组体ompA-pcDNA3，即C．t的DNA疫苗，希望能为C．tDNA疫苗的动物实验研究提供材料。实验中选用的真核表达载体为pcDNA3质粒，目的基因为C．t的MOMP编码基因ompA，使用的C．t标本来源于性传播疾病门诊患者的尿道及宫颈分泌物。标本经裂解处理后做为PCR扩增的模板，先用C．t种特异性引物扩增ompA基因，以此来筛选C．t阳性的临床标本；PCR产物经基因测序，确定C．t临床标本的血清型；然后用带限制性酶切位点的血清型特异性引物，PCR扩增此特定血清型的ompA基因；扩增的目的基因与载体经酶切后，连接重组，转化大肠杆菌；最后重组子经抗生素平板筛选、PCR扩增筛选、酶切鉴定后，阳性重组子送测序公司，进行重组子的DNA序列测定。实验显示：PCR扩增方法筛选C．t阳性的临床标本，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，扩增产物大小约1.2Kb，基因测序确定是C．t J血清型；PCR扩增天津医科大学硕士研究生论文 J型c.t MoMP编码基因。mPA，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，扩增产物片段约1.OKb，与预期的1022bp一致;PCR扩增方法筛选重组子ompA一PcDNA3，琼脂糖凝胶电泳提示。mpA基因存在于PcDNA3质粒中;双酶切法筛选重组子，酶切产生了5.4Kb和1 .oKb两个片段，进一步证明omPA基因存在于 PcDNA3质粒中;阳性重组子进行基因测序，证明插入PcDNA3载体中的墓因片段与genebar水中J型C .t的 omPA基因序列一致。上述结果证明本实验成功构建了C.tJ型野生株。mpA基因的重组子ompA一peDNA3。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R346

【参考文献】