人骨形态发生蛋白-2在大肠杆菌中的高效表达

发布时间：2020-08-09 16:23

【摘要】： 目的：克隆人骨形态发生蛋白-2（hBMP-2）完整成熟肽基因，并在大肠杆菌中高效表达，获得具有生物活性的重组人BMP-2。方法：①依据Genbank中hBMP-2的序列合成两条引物，从人胎儿骨组织中提取的总RNA，通过反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）得到hBMP-2完整成熟肽基因。将所得的基因片段插入克隆载体pUC-19中，克隆并测序。② 设计出5'端突变引物，通过PCR的方法，将hBMP-2基因5'端突变为E.Coli所偏好的密码子，以利于其在E.Coli中的表达。将突变的 hBMP-2基因插入表达载体pBV220中，转化E.Coli BL21，温度诱导，并探讨不同活化时间与诱导时间对表达的影响。③将表达所得包涵体，经 DEAE阴离子交换层析和S-300分子筛凝胶过滤纯化，体外复性获得 rhBMP-2，用小鼠肌袋模型测活。结果：①测序结果显示所克隆基因与 Genbank上完全一致，预想突变位点已突变。②重组质粒pYR （pBV220-hBMP-2'）经限制性核酸内切酶酶切分析表明：突变的 hBMP-2基因成功插入表达载体pBV220中，转化E.Coli BL21后温度诱导，最佳的活化状态为OD_(600nm)≈0.45，最佳诱导时间为4h。表达量达30％。③重组hBMP-2经纯化后纯度达95％以上，4周后见小鼠肌肉内有新生骨生长。结论：①克隆了hBMP-2完整成熟肽基因并成功将 hBMP-2基因的5'端突变为E.Coli所偏好的密码子。②重组hBMP-2 表达载体pYR在E.Coli BL21温度诱导表达，所得重组蛋白具有较理想的成骨活性。
【学位授予单位】：第一军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2000
【分类号】：R341

【引证文献】