间充质干细胞上清液对2,5-己二酮致PC12细胞凋亡的保护作用及其机制研究

发布时间：2020-08-17 09:08

【摘要】：目的:观察间充质干细胞上清液(MSC-CM)对2,5-己二酮(HD)诱导PC12细胞凋亡的保护作用,并探讨其作用机制。材料和方法:体外培养、纯化Wistar大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),并收集其第5代MSC-CM。将实验分为四组:(1)空白对照组:不对PC12细胞进行任何处理。(2)MSC-CM对照组:向PC12培养体系中加入40%的MSC-CM。(3)HD暴露组:PC12细胞暴露于20 mmol/L HD 24 h,制备PC12细胞损伤模型。(4)MSC-CM保护组:20 mmol/L HD作用于PC12细胞24 h后,分别加入10%、20%、40%体积的MSC-CM。以上各组用MTT法检测细胞活性;Hoechst 33342观察细胞凋亡形态学改变,流式细胞仪检测细胞凋亡率;Real-time RT-PCR检测Bax、Bcl-2和BMSCs中NGF的表达;Western-Blotting检测Bax、Bcl-2、细胞色素C(cytochrome c)以及BMSCs中NGF蛋白表达量;rhodamine 123法检测线粒体膜电位(MMP)的变化;Bradford法检测待测样品单位蛋白中caspase-3活性;ELISA法对3-6代MSC-CM中NGF含量进行测定。结果:1.MTT结果与空白对照组比较,MSC-CM对照组PC12细胞的活性无显著差异(p0.05),而HD暴露组的PC12细胞活性显著降低(p0.05)。MSC-CM保护组与HD暴露组相比,PC12细胞活性明显提高(p0.05),且呈剂量反应关系。2.细胞凋亡结果Hoechst 33342观察细胞凋亡形态改变,对照组细胞核核质均匀细胞核呈圆形或椭圆形,HD暴露组细胞呈新月形,核仁消失,染色质聚集移动,有特征性凋亡小体形成,而MSC-CM保护组PC12细胞特征性凋亡小体细胞有所减少;AV/PI双染流式细胞仪对PC12细胞进行凋亡率的检测中发现,HD暴露组PC12细胞的凋亡率较对照组显著增加(p0.05),加入MSC-CM后PC12细胞凋亡率逐渐降低。3.Bax、Bcl-2的m RNA表达结果HD暴露组中,PC12细胞Bax的m RNA表达明显高于对照组(p0.05),而加入MSC-CM后Bax的m RNA表达较HD暴露组明显降低(p0.05),并且随着MSC-CM体积的增加而降低;PC12细胞Bcl-2的m RNA表达,HD暴露组较对照组明显降低(p0.05),而MSC-CM保护组m RNA表达明显高于HD暴露组(p0.05);Bax与Bcl-2 m RNA的比值,HD暴露组与空白对照组相比,比值明显增加(p0.05),而MSC-CM保护组较HD暴露组比值降低(p0.05)。4.Bax、Bcl-2的蛋白表达结果HD暴露组PC12细胞Bax蛋白表达量显著高于空白对照组(p0.05),而MSC-CM组Bax的蛋白表达较HD暴露组有所降低(p0.05),并且随着MSC-CM体积的增加而减少;PC12细胞Bcl-2蛋白表达,HD暴露组中明显低于空白对照组(p0.05),MSC-CM保护组明显高于HD暴露组(p0.05),且随着MSC-CM体积分数的增加而增加;Bax与Bcl-2的比值Bax/Bcl-2,HD暴露组与空白对照组相比,其比值明显增加(p0.05),MSC-CM保护组较HD暴露组比值降低(p0.05)。5.MMP的检测结果HD暴露组PC12细胞较空白对照组相比其线粒体膜电位显著降低(p0.05),MSC-CM保护组较HD暴露组逐渐增加,膜电位值由24.28%上升到38.15%、51.45%和66.47%。6.Cytochrome c的Western-Blotting结果线粒体内cytochrome c蛋白表达,HD暴露组较空白对照组显著降低(p0.05),MSC-CM保护组与HD暴露组相比cytochrome c的蛋白表达明显上升(p0.05);另一方面在胞浆中cytochrome c的蛋白表达情况与在线粒体中相反。7.Caspase-3活性的检测结果HD暴露组与对照组相比,PC12细胞caspase-3的活性显著增加(p0.05),而MSC-CM保护组与HD暴露组相比活性降低(p0.05)。8.NGF水平的检测结果BMSCs中NGF的m RNA在3到6代中均有所表达,而在第3代m RNA的表达量最高;蛋白表达量与Real-time RT-PCR结果相似;ELISA法测3到6代MSC-CM中NGF的含量根据相对曲线算出的MSC-CM中NGF相对值分别为52.41,49.17,24.11和23.38pg/ml。结论:HD诱导PC12细胞凋亡;MSC-CM对HD诱导PC12细胞凋亡具有保护作用;该保护作用可能与抑制线粒体依赖的caspase-3通路有关;NGF在MSC-CM拮抗HD诱导PC12细胞凋亡中可能起到重要保护作用。
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R329.2

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本文编号：2795120