小鼠β-酪蛋白基因重组体构建、表达及其产物的纯化和酶解液的免疫功能研究

发布时间：2020-08-15 19:48

【摘要】： 研究背景乳源性的?-酪蛋白(β-CN)含有丰富的生物活性肽,这些生物活性肽在体内发挥着各式各样的生理功能,因此,?-酪蛋白被誉为乳蛋白中的战略活性蛋白。制备和提取?-酪蛋白为研究?-酪蛋白及其中包含的生物活性肽具有重要的意义,也为开发乳品奠定一定基础。传统方法获得?-酪蛋白主要是从乳中分离纯化,但获得的?-酪蛋白产量较低,且分离纯化难度较大,为?-酪蛋白的研究和开发带来不便。随着生物技术飞速发展,利用基因工程手段直接获得?-酪蛋白为人们提供了新的思路和方法。各种哺乳动物和人?-酪蛋白高度保守,尤其小鼠?-酪蛋白与人的?-酪蛋白又有很高的同源性,本研究以小鼠?-酪蛋白作为研究对象。目的构建小鼠?-酪蛋白基因重组体,在大肠杆菌内诱导其表达,纯化?-酪蛋白并研究其酶解液的部分功能。方法从哺乳期小鼠乳腺组织提取总RNA,通过RT-PCR获得?-酪蛋白基因编码序列,再与融合蛋白表达载体pGEX-KG连接,构建原核表达质粒pGEX-KG-β-CN,将其转化到E.coli DH5α宿主内,在20℃,用低浓度的IPTG进行长时间的诱导,超声破碎细菌后SDS-PAGE分析。利用?-酪蛋白基因重组体表达的融合蛋白氨基端带有GST标签,用商品化的GST beads(Glutathione Sepharose 4B),亲和层析的方法纯化β-CN融合蛋白。以纯化的β-CN融合蛋白为底物,用胰蛋白酶、糜蛋白酶作用底物60min、90min、120min、150min,得到不同时间段的酶解液。通过体内和体外两系列实验,观察了β-CN融合蛋白酶解液对大鼠和小鼠淋巴细胞转化的影响。结果经限制内切酶酶切图谱分析和DNA序列测定证实所构建的质粒pGEX-KG-β-CN,SDS-PAGE证实诱导表达后所获得的融合蛋白分子量为52KD,表达量占菌体蛋白的12.4%且主要存在于上清液中。纯化后产物经胰蛋白酶、糜蛋白酶作用90min、120min,其对大鼠和小鼠淋巴细胞转化有明显的促进作用。结论成功构建重组表达质粒pGEX-KG-β-CN,并在大肠杆菌中获得了可溶性表达。成功纯化了融合蛋白,其酶解液对大鼠和小鼠体内外淋巴细胞转化有促进作用。
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R346
【图文】：

电泳图,电泳图,产物,琼脂平板

图 2 RT-PCR 产物的电泳图Fig 2 Electrphoresis of the RT-PCR Product DNA Marker; 2-5: PCR product of -casein cDN 的活化EX-KG 用双蒸水从滤纸上洗脱下来，转挑取 LB 琼脂平板（含氨苄青霉素 100μg培养基中进行扩增，小量提取质粒经 1％

裂解液,细菌,条带,对数生长

的克隆菌 pGEX-KG-β-CN 培养至对数生长0－6 小时，各样本取相同的蛋白量作 SDS附近能见到一条明显的条带，与我们预计，对照组（0 小时）在 52 kDa 处未见条带X-KG-β-CN 在大肠杆菌种得到了正确的果扫描，计算 52kDa 处蛋白条带的积分值白表达随诱导时间增加而增多，诱导 4 小达的最佳时相为 4 小时。进一步超声破碎白大部分存在上清液中，这说明了我们的续的纯化提供了方便。蛋白量为 185 μg/m见图 6 和 7。7 6 5 4 3 2 1 M

细菌蛋白质

图 7 细菌蛋白质的 SDS-PAGEFig 7 SDS-PAGE of bacterium protein,3: bacterial protein induced by IPTG for 2, 3, 4 h, respectived by IPTG for 4h; 5:bacterial protein in precipitation indu亲和层析纯化后的 GST-β-CN 融合蛋白-KG-β-CN 经 IPTG 诱导表达，菌体超声破碎，one SepharoseTM4B)结合，用还原型谷胱苷肽洗GE，可见 52kDa 处有一明显的蛋白条带。如图度为 0.58mg/ml，纯化后的蛋白纯度为 95%左右

【参考文献】