汉城病毒M片段和汉滩病毒部分S片段核酸疫苗pEGFP-M-S的构建及基因免疫研究

发布时间：2020-08-17 14:07

【摘要】：目的:我国流行的肾综合征出血热主要由汉坦病毒属的汉城型病毒和汉滩型病毒引起,多属汉滩型为主或汉城型为主的混合型疫区,仅接种单一型别的汉坦病毒疫苗,不能完全预防其他型病毒的交叉感染。因此,迫切需要研制和开发双价或多价汉坦病毒疫苗。1、本课题的第一部分利用含有卡那霉素抗性基因的真核质粒表达载体pEGFP,通过构建同时含有汉城型病毒Z37株完整的M片段和汉滩型病毒国际标准株76-118株S基因中编码核蛋白主要抗原表位约0.7kb片段的重组核酸疫苗pEGFP-M-S,希望能够同时充分发挥有保护性抗原作用的M片段编码的糖蛋白、S基因编码的核蛋白的保护性免疫作用,为利用含有两型汉坦病毒抗原性片段的重组DNA疫苗进行基因免疫的研究奠定物质基础,以期在疫区能够同时控制两型汉坦病毒的感染,为研制汉坦病毒的DNA疫苗奠定基础。 2、本课题的第二部分首先用不同剂量的重组质粒pEGFP-M-S以肌肉注射的方式对BALB/c小鼠进行基因免疫,检测免疫小鼠的特异性的体液免疫和细胞免疫应答状况。然后对鼻腔滴入免疫方式和肌肉注射免疫方式对免疫小鼠产生的特异性的体液免疫和细胞免疫应答的状况进行比较研究。 方法:1、以质粒pUCM(含有汉城型病毒Z37株M片段1-1678bp)为模板,PCR扩增47-1666bp的产物,装入质粒pcDNA3.1,记为重组质粒M1;以质粒pGEM(含有汉城型病毒Z37株M片段1601-3638bp)为模板,PCR扩增1661-3445bp的产物,装入质粒pcDNA3.1,记为重组质粒M2;将质粒M1和M2分别用BamH Ⅰ和Kpn Ⅰ双酶切,分别回收7.1kb的大片段和1.8kb的小片段,连接起来,记为重组质粒pcDNA3.1-M。以质粒PJSA1175-HVS(含有汉滩病毒76-118株S基因)为模板,PCR扩增40-795bp的产物,装入质粒pEGFP,记为重组质粒pEGFP-HTNV-S0.7。用Xho Ⅰ和Pst Ⅰ双酶切pcDNA3.1-M,回收3.4kb的小片段,与经同样双酶切并回收5.4kb大片段的pEGFP-HTNV-S0.7用酶切位点连接,构成4.1kb的重组基因,记为pEGFP-M-S,并转
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2005
【分类号】：R392
【图文】：

以质粒pUCM为模板，用分别含有劝01的上游引物Pl和B田旧Hl的下游引物P2进行PCR扩增、割胶回收，与质粒PcDNA3.1同时进行众01和BamHI双酶切、低温连接、转化，得到若干个转化子的PCR鉴定结果见图1，显示约1.6kb大小的单一条带，与预期大小相符。以质粒pGEM为模板，用分别含有B出的Hl的上游引物P3和KPnl及Pstl的下游引物P4进行PCR扩增、割胶回收，与质粒PcDNA3.1同时进行B田叮Hl和KPnl双酶切、低温连接、转化，得到若干个转化子在序列的下游同时含有Pstl酶切位点。其PCR鉴定结果见图2，显示约1.skb大小的的单一条带，与预期大小相符。

下游引物P4进行PCR扩增、割胶回收，与质粒PcDNA3.1同时进行B田叮Hl和KPnl双酶切、低温连接、转化，得到若干个转化子在序列的下游同时含有Pstl酶切位点。其PCR鉴定结果见图2，显示约1.skb大小的的单一条带，与预期大小相符。

图3.重组质粒Ml、MZ的酶切鉴定MZ;3.质粒penN^3.1一A卜);4，5.重组质粒M2用BamHI和Kpnl的PCR产物;7.重组质粒Mi用xhol和BamHI双酶切;8.重组质粒产物3.ldentifieationofereombinnatPlasmidsMInadMZbyerstrietionenZymesdLnael，2:ereombinnatPlasmidMZLnae3:PlasmidPeDNA3.l一A(一)nae4，5:Restrietionen习mesdigestofreeombinnatPlasmidMZbyBamHLane6:PCRProduetofreeombinnatPlasmidMZnae7:Restrietionen刃mesdigestofreeombinnatPlasmidMlbyXhoInadLnaes:PCRProduetsofreeombinnatPlasmidMI粒peDNA3.1一M的酶切鉴定盒抽提重组质粒Ml和MZ，将质粒Ml和MZ分别用BmaHI收约7.Ikb的大片段和1.ksb的小片段;或者用乃。I和BmaH.6kb的小片段和.73kb的大片段，分别将相应回收的大、小片

【参考文献】

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本文编号：2795425