微丝骨架在登革病毒感染ECV304细胞中作用的研究

发布时间：2020-09-01 16:15

　　登革病毒(dengue virus,DV)是黄病毒属的单股正链RNA病毒,广泛流行于热带和亚热带地区,主要引起DF和DHF。DHF的主要特点是血浆渗漏,提示血管内皮细胞(VEC)出现了功能障碍。同时免疫荧光和滴度测试证明,登革病毒能够在VEC中增殖。因此,我们认为VEC既是DHF患者发生休克的效应细胞,也是登革病毒在体内增殖的靶细胞之一。研究发现,细胞骨架微丝能够介导VEC的功能和形态变化。微丝又称肌动蛋白纤维(fibrous-actin,F-actin),由球形肌动蛋白(global-actin,G-actin)首尾相连而成,是有极性的动态结构。它们一般以成束或成网的形式存在于细胞质膜内,构成所谓的细胞皮质区,调控细胞的形状、表面突起和运动等。当受到某些细菌或病毒的感染时,微丝能解聚并形成新的结构,参与进入、胞内运输及释放。微丝研究中最常用的药物有2类:一类与微丝的正端结合,起抑制G-actin聚合的作用,如细胞松弛素(cytochalasin,cyto),Lat A;另一类与微丝的侧基结合,贯穿微丝的生长,起稳定F-actin和对抑制解聚的作用,如鬼笔环肽(phalloidin),jasplakinolide(jas)。本研究主要以来自胎儿脐静脉的VEC样细胞株ECV304为对象,以登革II型病毒(DEN-2)为感染材料, 应用干扰微丝骨架功能的药物 jas 和 cyto D,探讨登革病毒感染与该细胞相互作用过程中的分子机制--微丝骨架的作用,期望能从不同的角度分析细胞微丝骨架在登革病毒感染宿主细胞过程中的作用。本研究主要结果与结论如下: 1. 登革病毒感染引起ECV304和HUVEC细胞微丝骨架的解离聚合: 本实验共设2组,即一般感染组与正常对照组。在正常ECV304细胞中,F-actin主要以应力纤维(stress fiber)的形式存在,广泛分布于细胞内,包括细胞边缘部分。以MOI=10对细胞进行感染,感染5分钟内,细胞微丝出现了解聚;感染10分钟,微丝解聚的程度进一步扩大,较多的短 F-actin积聚形成团块;感染后30分钟,微丝本课题为国家自然科学基金项目 30170848和30300303资助 WP=9 几乎完全解聚,部分F-actin 呈大小不一、数量不等的环/点状;感染1小时后,部分微丝束开始恢复,主要分布在细胞膜下;感染24、48、72和120小时后,由于病毒大量复制、病毒蛋白堆积,能够再次引起长F-actin的全面解聚;其中有些细胞内形成了特殊的短F-actin结构,与病毒蛋白的分布紧密相伴,形态类似文献所报告的肌动蛋白尾 (actin tail) 。本实验结果发现,在登革病毒感染的不同阶段,ECV304细胞的微丝骨架能够出现一定程度的解聚和排列变化。这提示微丝骨架可能参与了病毒与ECV304细胞的相互作用,同时微丝的变化可能是登革病毒感染后血管内皮细胞功能变化的原因之一。免疫荧光双染色实验发现,微丝解聚与否和细胞核周登革病毒抗原的堆积没有必然的联系。在某些病毒抗原阳性的细胞内,微丝骨架仍然十分完整。在出现微丝解聚的细胞中,病毒蛋白大都呈现“火焰状”分布,提示微丝解聚与病毒蛋白合成后期的运输或组装有关。 2. 微丝骨架干扰药物抑制了登革病毒在ECV304细胞内的增殖幅度本实验(MOI=10)共设置了3组:一般感染组、jas高浓度组(1μmol/L)和 cyto高浓度组(1ng/L)。2种药物在病毒吸附之后立即添加在培养基中,维持5天。在没有药物作用的情况下,病毒滴度在感染后第2天即显著增加,在第3天达到峰值,随后逐渐下降。两个药物组中的病毒滴度也在第3天达到最高,变化趋势与一般感染组基本一致,但数量较之降低了约35%。这提示jas 和 cyto D能够干扰登革病毒的增殖。随后,我们针对病毒增殖周期的不同环节,进一步开展了下面的药物干扰实验。 3. 微丝骨架干扰药物抑制了登革病毒进入ECV304细胞本实验(MOI=0.01)共设置了5组:一般感染组、jas高浓度组(1μmol/L)、jas低浓度组(0.1μmol/L)、 cyto高浓度组(1ng/L)和cyto低浓度组(0.1ng/L)。预先用不同浓度的jas和cyto D处理vero细胞1小时,再用登革病毒感染。结果发现两种药物对登革病毒的感染率都有抑制作用,且呈剂量依赖关系。其中jas的作用更显著,jas高浓度组的感染率为一般感染组的57%,而jas低浓度组约为70%左右。 4. 微丝骨架干扰药物降低了子代登革病毒从ECV304细胞中释放的数量本实验(MOI=10)共设置了3组:一般感染组、jas低浓度组(0.1μmol/L)和 cyto WP=10 低浓度组(0.1ng/L)。根据预实验结果,我们认为感染后6～8小时是登革病毒从ECV304细胞释放的关键时段,于是在感染后4小时和6小时施加两种药物,作用2小时后分别收集培养上清,检测病毒滴度。结果发现感染后第6小时和第8小时,两药物组上清中的病毒滴度均显著低于一般感染组,约为其50%左右。同时,我们收集并检测了感染后8小时的细胞内的病毒滴度,发现2药物组的细胞内病毒滴度也呈下降趋势,约为一般感染组的40～50%。这说明jas和cyto D并非单纯抑制了病毒的释放,而可能影响了病毒复制、病毒蛋白的合成组装与释放等多个环节,进而减少了释放出胞的子代病毒数量。 5. 登革病毒感染增加了ECV304细胞的通透性 transwell细胞模型能够部分模拟血管内皮细胞屏障的功能,适于分析某种因素单独或多种因素联合对细胞屏障功能的影响。虽然无法完全重建体内血管的构造,但是在没有合适的DHF动物模型之前,它仍然不失为研究内皮细胞通透性的有利工具之一。本实
【学位单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2004
【中图分类】：R373
【部分图文】：

登革,感染后,微丝骨架

登革病毋感染后，HUVEC微丝骨架的改变.(材米受感染的正常细胞

【共引文献】