人骨髓间充质干细胞生物学特性的研究及体外对异基因T淋巴细胞表型的影响

发布时间：2020-09-02 21:03

　　骨髓中存在一定数量的间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)，能够通过分化形成多种中胚层组织。由于MSCs具有吸附塑料表面的特性以及特异的表面标志(高表达CD166、CD29、CD13、CD105，不表达CD34、CD45、HLADR)，因此可以从骨髓中分离出来并通过流式细胞技术加以鉴定。研究证明MSCs可为骨、软骨、肌腱、心肌等组织的修复和重建提供细胞来源，并且可以支持体内造血、诱导T细胞对抗原的低反应性、降低异基因造血干细胞移植后移植物抗宿主病(Graft-versus-host disease，GVHD)的发生率和严重程度，但其免疫调控的机制尚不清楚。人骨髓中的MSCs含量极少，10~4-10~5个骨髓单个核细胞中仅含1个MSC，难以满足组织工程和自体或异体移植的需要。因此，体外扩增MSCs并研究其生物学特性尤为重要。本实验采用Percoll(1.073g／ml)密度梯度离心法分离出骨髓单个核细胞，将之接种于含10％FBS的LG-DMEM培养基中，利用MSCs黏附于塑料表面的特性，获得纯化的MSCs。采用本方法细胞贴壁快，易纯化，P3代细胞的均一性达到98％以上，原代培养和传代培养显示，在体外培养条件下人骨髓MSCs有活跃的增殖能力，来源于骨髓5×10~6个单个核细胞(Mononuclear cell，MNC)的MSCs，经体外培养扩增P0、P5、P10代细胞数分别为10~6、10~8、10~(10)个，原代细胞潜伏期长，P10代以后的细胞生长速度变缓慢，出现衰老征象。实验结果为临床应用MSCs提供了参考依据。本实验同时定时、定量研究了MSCs对异基因T淋巴细胞表型的影响，以经CO~(60)照射后的不同数量的MSC作为基底层细胞，接种体外分离纯化的相同数量的异体T淋巴细胞，分别于0小时、24小时、72小时、7天后用流式细胞技术测定各组T细胞表型的变化并计数各组T细胞数。结果显示，当T细胞数与MSC数 4 中文摘要一比例为25:1(A组)、50:1(B组)时，CD4‘CD25‘细胞与对照组相比均明显增加(A组P=0.0023，B组P=0.0031)，CDS‘细胞明显增多(A组P=0.0106，B组 P=0 .0148)，两者均随着共培养时间的延长而表达量逐渐增加，A组和B组之间无明显差别(P=0.2350)，实验组(A组和B组)与对照组相比，CD3+、CD4‘、 CD25+细胞无明显差别;当T细胞数与MSC数比例为100:1(C组)时，与对照组相比，CD4表达略上调，但无统计学意义，CD3‘、CDS‘、CD25‘、CD4‘CD25‘细胞无明显差别。随培养时间的延长，与MSC共孵育组和单独T淋巴细胞培养组中T 淋巴细胞的数量均呈下降趋势，在第7天时T细胞单独培养组细胞数减少约 21.5%，与MSC共孵育组T淋巴细胞数:A组减少65.00rk以上，B组减少60.00k，C 组减少12.5%。以上结果提示，MSCs与T淋巴细胞共培养时，当加入的MSCS达到一定的数量时(T细胞:MSC毛50:l)可以引起T淋巴细胞的表型发生改变，表现为CD4℃D25十细胞和CDS+细胞明显增多，并且抑制T淋巴细胞的增殖;而当加入的MSCS小于一定的数量时(T细胞:MSC〕100:1)，T淋巴细胞的表型无明显改变，并且刺激T淋巴细胞增殖。表明MSC的负调控机制可能与诱导CD4℃D25+ 免疫调节性T细胞以及CDS+T细胞增多有关，同时也表明MSC对T淋巴细胞的作用与MSC的数量有关。实验结果为防治异基因造血干细胞移植中GVHD和VGHR的发生、诱导免疫耐受提出了一条新的思路，为临床异基因造血干细胞移植时输注MSCS预防GVHD的 MSCS输注数量提供了参考依据。
【学位单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2004
【中图分类】：R392
【部分图文】：

连续培养,细胞,纺锤状细胞,瓶接

第5天进入对数生长期，第9天细胞数量增加了约10倍，平均13一14天细胞达90%融合，这时的细胞排列有一定的方向性，呈旋涡样生长，细胞铺满了瓶底(图2)，每瓶接近900/0融合的MSCS经胰酶消化可获得(1一2)x106个细胞，平均8一9天传代1次。消化传代的细胞于24小时内完全贴壁，形态与原代细胞相似。体外扩增至第3代、5代、10代时细胞数量分别为:2.35土1.08x107、2.78士1.34又10习、1.32士0.76xl0，。。MSCS传至第10代以后，细胞胞体增大，细胞质疏松，可见空泡，并可见折光基质产生，细胞增殖变缓慢。图1原代MSC培养72小时后出现的纺锤状细胞(xZOO)图2原代MSC连续培养两周细胞达90%以上融合后的?

纺锤状细胞,细胞克隆,纺锤形,刚接

MSC的分离纯化及形态学观察刚接种的原代MSCS细胞呈圆形，大小不一，原代培养的MSC通常在培养72小时左右出现分散存在的贴壁的细胞克隆，细胞形态均一，呈纺锤形(图1)

生长曲线,淋巴细胞,T细胞,T淋巴细胞

实验结果巴细胞的生长情况SCs与外周血T淋巴细胞共孵育7天后，显微镜下观察可见共孵育数量较T细胞单独孵育组明显减少(图3.1、3.2)，T细胞单独孵育后较培养前细胞数量有所减少，但无统计学意义。T细胞的生长曲由生长曲线可见随培养时间的延长，与MSC共孵育组和单独T淋巴T淋巴细胞的数量均呈下降趋势，在第7天时T细胞单独培养组细.5%，与MSC共孵育组T淋巴细胞数:MSCS为2x10V孔组(C组5%;MSCs为4xlo‘/孔组(B组)时减少60.0%;MSCs为8x104/孔减少65.0%。

【相似文献】