蝮蛇毒金属蛋白酶的cDNA克隆及表达

发布时间：2020-09-07 21:30

　　从江浙蝮蛇的毒腺中提取总RNA，经RT-PCR扩增出一个长为 987bp的金属蛋白酶基因，该基因编码317个氨基酸的开放性阅读框（非全长），包括酶原前肽结构域（Proprotein domain）的一部分，完整的金属蛋白酶结构域（Metalloproteinase domain）和去整合蛋白结构域（Disintegrin domain）。在酶原前肽结构域含高度保守的PKMCGVT序列（又称半胱氨酸开关），在活性中心金属蛋白酶结构域中含高度保守的锌离子结合序列 HEXXHXXGXXH，去整合蛋白结构域中的Arg-Gly-Asp（RGD）序列被认为能与血小板膜上的整合蛋白结合，具有抑制血小板聚集的功能。该序列与其它蛇毒的金属蛋白酶/去整合蛋白具有较高的同源性，属于N—Ⅱ类金属蛋白酶。根据推导出的氨基酸序列，我们还探讨了该酶原前体可能的加工机制。将该基因各功能结构域分别克隆至表达载体pET-22b，转化入大肠杆菌BL21中，诱导表达，经SDS-PAGE检测，只含金属蛋白酶结构域以及既含金属蛋白酶结构域又含去整合蛋白结构域的两重组质粒在相应大小处均有表达条带，表达产物约占细菌蛋白总量的20％，并以包涵体的形式存在。纯化包涵体后，将产物变性成可溶形式，然后用Ni-NTA对表达产物纯化，SDS-PAGE检测为一条带，包涵体的复性是一项非常困难的工作，尤其是对含有多对二硫键的蛋白质，因此复性后冻干，测它的某些活性时，结果的重复性不太理想。
【学位单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2001
【中图分类】：Q55

【引证文献】