重组腺相关病毒体外诱导人树突状细胞的研究

发布时间：2020-09-19 09:42

　　 目的：分别构建携有hGM-CSF、hIL4和hTNFα基因的AAV病毒，依次将这些基因导入外周血单个核细胞（PBMC），使后者持续、有效地分泌相应的细胞因子来体外诱导DC，弥补外源性细胞因子半衰期短价格昂贵的缺点，为最终探求一种更经济、更方便的体外诱导获取DC的方法奠定基础。 方法：将携带有细胞因子的重组腺相关病毒载体（AAV/cytokine vector）与辅助质粒pHELPER共转染到293细胞内包装成重组腺相关病毒，测定病毒滴度。从健康人外周血中分离出单核细胞然后用病毒感染之，提取总RNA，以RT-PCR来检测三种细胞因子在mRNA水平的表达。另外用同样的方法从健康人外周血中分离出单核细胞，分成三组，一组用携有细胞因子的重组腺相关病毒依次感染PBMC，通过自分泌和旁分泌相应的细胞因子持续作用来培养DC；一组直接用hGM-CSF、hIL4和hTNFα作用PBMC培养DC；另外一组只加入293细 WP=8 胞裂解液培养PBMC。将这三组培养数天的细胞，通过动态观察、FACS分析检测CD表面标记分子（CD14、CD40、CD83、CD86）的表达，以及用混合淋巴细胞反应等，进行鉴定比较重组AAV和外源性细胞因子的作用差异。 结果：（1）成功包装病毒，并用非同位素（酶标）特异性探针斑点杂交法检测病毒滴度为107-108eg/ml。（2）提取感染病毒的PBMC细胞的总RNA，以RT-PCR检测到三种细胞因子mRNA的表达。（3）基因诱导培养的第十天可获得典型的DC。经光学显微镜和电镜观察及流式细胞仪分析证实，所诱导的细胞具有典型的形态和结构特征，有较高的表面标记分子（CD14、CD40、CD83、CD86）的表达。(4)MLR的检测表明，基因诱导的DC具有较强的刺激同种淋巴细胞反应的能力。 结论：（1）rAAV病毒能将外源基因导入真核细胞，有效和持续地表达，并减少了污染机会。（2）基因诱导可获取典型的DC细胞。（3）rAAV诱导DC是一种经济、方便和有效的体外诱导获取DC的方法。
【学位单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2003
【中图分类】：R373
【部分图文】：

(由刘勇博士惠赠), 其结构如图 2 所示Fig1-1 Conformation of AAV/cytokine vector图 1-1 AAV/ cytokine vector 质粒结构示意图Nco BamHHpaEcoRMspAAV/Cytokine/NeoTRTRAmpEcoRPolyASph

Fig2-3 Kinetics of CD expression rate of DC induced by rAAV图 2-3 rAAV 诱导的 DC 表面 CD 分子表达率的 FACS动态分析注 293-lysate 7th day 为加 293 细胞裂解液培养第七天的细胞

Fig2-7 Mononuclear cell from peripheral blood图 2-7 刚分离出来的外周血单个核细胞optical microscope 100 optical microscope 400光镜 100 光镜 400Fig2-8 At 2nd day (delivery of GM-CSF gene into cell after 24h by rAAV)图 2-8 基因诱导培养第二天(AAV/GM-CSF 导入细胞 24 小时)

【参考文献】

相关期刊论文 前1条

1 范萍,武正炎,王水,查小明,甄林林;人外周血中树突状细胞的诱导、培养及其表面标记的初步研究[J];南京医科大学学报;2002年01期

本文编号：2822351