iNOS在脂多糖致热大鼠肝脏表达的免疫组化研究

发布时间：2020-09-22 11:16

　　目的肝脏是机体产热的重要器官，参与体温调节。近年来，肝脏在体温调节方面的作用日益受到重视。但到目前为止，关于iNOS在肝脏的生理和病理状态下所起的作用却少有研究。因此，本实验从上述问题着手，基于NO广泛的生理和病理作用，研究细菌脂多糖引起的内毒素性发热中，iNOS在大鼠肝脏中的表达，从而进一步探讨iNOS在体温调节中的作用。实验方法方法：(1)测量体温：在实验前3天每天让动物在实验环境中适应3小时，大鼠放在特制的鼠笼内，将测温探头插入大鼠直肠内8cm，第4天进行发热实验。实验室温度控制在20-24℃。用无热原生理盐水将脂多糖稀释成100μg／ml，实验时按1mg／kg剂量给大鼠腹腔注射。体温测量时，将大鼠放在特制的鼠笼内，将测温探头插入直肠内8cm，并用胶布固定于尾根部，待体温恒定后测三次体温(每次间隔10min)以其均值作为基础体温。然后各组注射相应药物，以后每间隔1小时记录一次体温，直至实验结束。为了避免生物节律的影响，每次实验均在上午8时30分开始，采用分批交叉进行各组实验。(2)免疫组织化学技术：将大鼠用20％氨基甲酸已酯5ml／kg腹腔注射麻醉，灌流固定，取肝组织迅速置于含4％多聚甲醛的PBS液(0.01mol／L，Ph7.4)，固定6小时，再移入15％的蔗糖磷酸缓冲液中4℃过夜，准备切片。次日将标本用OCT包埋，恒冷切片机温度调到-20℃，行10μm冰冻切片。用3％H。O。室温下处理切片10min；用5％正常羊血清室温下处理 3o而n；在每张切片上滴加50…一抗PB液（效价1：ppL4℃下过夜。次日，每张切片依次滴加生物素标记的羊抗兔IgG（效价 1 ：10o乃7℃30ruin；滴加辣根酶标记链霉卵白素37℃30dn。然后将新鲜配制的DAB显色剂滴于标本上，显色10min，充分水洗后，苏木素复染。常规剃度脱水，树胶封片。使用显微图象分析技术，测定iNOS阳性反应产物的整合光密度值、％阳性面积、平均灰度值。所有数据以均值。标准差k土S）表示，统计分析使用多样本均数方差分析进行显著性差异的比较。结果 LPS发热组在腹腔注射LPS后体温逐渐的升高，在注射后6 小时达到最高值，体温升高1．38℃，明显高于对照组u＜o．01厂而后逐渐下降，在注射LPS后9小时大鼠的体温仍高于对照组P ＜o．01人口s发热组在升高体温的同时，也有效的增高肝脏内 mOS活性，与对照组比较，差异非常显著河＜O．＊1人切片经免疫组织化学反应oAB染色后，可在光镜下观察到iNOS阳性产物呈棕褐色，主要分布在枯否细胞、胆管内皮细胞、噬酸粒细胞等细胞的胞浆中，在肝细胞膜上也可见iNOS阳性产物。采用显微图象分析系统测定iNOS阳性产物的整合光密度值、平均灰度值、％阳性面积。其中 LPS发热组3，6，gb iNOS阳性产物的整合光密度值与％阳性面积均高于正常对照组iNOS的整合光密度值和％阳性面积（P＜o．0门，且以LPS发热组6h的整合光密度值及防阳性面积为最大。平均灰度值则相反，LPS发热组3，6，gb的平均灰度值较对照组比较均有减少汗＜O对门，以LPS发热组6h的值为最小。将LPS发热组的体温变化与肝脏组织中iNOS活性变化做相关分析，结果表明二者之间存在正相关关系p＜o．01人 ·2· 结论 1．LPS诱导肝脏组织广泛iNOS阳性反应产物，并在大鼠注射LPS后6小时iNOS阳性反应产物最多。 TiNOS在肝细胞阳性反应产物主要分布在肝细胞膜。 3．LPS诱导的体温升高和肝脏中iNOS活性增高存在正相关关系，肝脏内iNOS参与体温调节。
【学位单位】：中国医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2003
【中图分类】：R392.1
【部分图文】：

后不阳整比

【参考文献】