携胰岛素调控基因系统的载体构建及鉴定

发布时间：2020-09-21 22:05

　　前言 1型糖尿病是由于胰岛细胞自身免疫损伤导致的单一蛋白质胰岛素绝对缺乏的一种代谢障碍性疾病，从而成为基因治疗的适应症。但是无序的胰岛素基因分泌不能使血糖保持在稳定的生理范围内，并产生极大的低血糖的危险。通过胰岛素生长因子结合蛋白1(IGFBP-1)插入到从鼠的肝脏中丙酮酸激酶(rLPK)的基因中提取的葡萄糖反应元件(GLRE)聚合成三倍体(GLRE)_3的下游，我们构建了一个胰岛素基因调控系统，分别受胰岛素抑制、葡萄糖激活，从而为构建可调控的胰岛素表达载体奠定基础。本试验的目的是 1：掌握从组织中提取DNA及PCR扩增目的DNA技术。 2：掌握基因重组技术及鉴定方法。 3：构建重组的含胰岛素基因调控系统的载体，为糖尿病基因治疗的进一步实验奠定基础。材料与方法 1 用饱和氯化钠法从肝脏(SD大鼠，雄性，四周龄)中提取基因组DNA。 2 用PCR方法从基因组DNA中扩增IGFBP-1启动子，琼脂糖电泳回收后标记为P_0。 3 三倍体基因pUC118(GLRE)_3的测序结果正确，购于TaKaRa公司。 4 携胰岛素调控基因系统pUC118(GLRE)_3-IGFBP-1的载体构建： 4．1 Kpn Ⅰ、Xba Ⅰ双酶切PCR产物P_0、载体pUC118(GLRE)_3过夜。 4．2 纯化连接，热转化至JM109。 4．3 筛选出pUC118(GLRE)_3-IGFBP-1。 5 pUC118(GLRE)_3-IGFBP-1重组体的鉴定： 5．1 Kpn Ⅰ、Xba Ⅰ酶切鉴定。 5 .2 PCR鉴定重组体。 5.3测序。实验结果 l从肝组织中调取IGFBP一1启动子: 1 .1从肝脏中提取基因组DNA后，取1过电泳，结果见图1。 1 .2从基因组DNA中PCR扩增IGFBP一1启动子，PCR产物全部上样回收后，取1过电泳，得到420bp目的DNA，与晓nebank X67493的IGFBP一1启动子基因大小相符，见图2。 2携胰岛素调控基因的重组体构建: 2.1双酶切P0及p UClls(GL旧卫)3，回收取lul电泳，见图3、4。 2.2转化菌平板培养PCR筛菌，取sul PCR产物电泳，以三倍体(GL RE)3为参照，与标准分子量比较，可见约720bp的片段，为三倍体GU伍与 IGFBP一1启动子碱基之和，见图5。 2 .3用分离纯化试剂盒提取质粒后，取lul电泳，结果见图6。 3.puc118(Gll伍)，一IGFBP一1重组体的鉴定: 3.1双酶酶切重组体后，将酶切产物电泳，得到42Obp、3.3kb基因片段，结果见图7o 3 .2重组体PcR扩增后电泳，与标准分子量对照，于720bp处出现清晰条带，结果见图8。 3.3重组体测序结果完全正确，见测序图。讨论 1型糖尿病应用胰岛素基因治疗要求胰岛素的分泌要与生物的代谢要求相适应，为达到这一目的，我们构建了一个胰岛素调控基因系统。这一基因调控系统是通过将胰岛素敏感的，肝特异性的，鼠胰岛素样生长因子结合蛋白·1(IGFBP一l)启动子插人到从鼠肝脏提取的丙酮酸激酶(d尸K)基因启动子—葡萄糖反应元件(GLRE)三倍体聚合后(GLf比3)基因的下游获得的。该基因调控系统在肝细胞中均有活性，并且其表达可被葡萄糖激活，被胰岛素抑制。经过大量基础研究，酶诱导已被证明为是增加基因转录的直接结果。C七rman等认定鼠胰岛素基因的启动子与其葡萄糖反应性有关的葡萄糖反应元件(Gll现)定位为slbl，片段。Robe沈son等证明鼠胰岛素样生长因子结合蛋白，1(IGFBP一l)启动子约420bp，主要受胰岛素的调控。本室通过分子生物学的基因点突变技术，使人胰岛素原基因的B一C链与C一A链连接处的二元碱变成四元碱，从而可被非p细胞内普遍存在的俪n酶所识别和剪切，合成成熟的胰岛素分泌到细胞外，参与糖尿病患者体内糖代谢的调节。并已通过转染肝癌细胞，检测细胞培养液证实有较高浓度的成熟胰岛素分泌。但是无序的胰岛素分泌不能使血糖保持在稳定的生理范围内，并产生极大的低血糖的危险，无法应用于动物模型及临床。为了应用基因治疗1型糖尿病，必须要有胰岛素分泌的完善调控。我们的目的是从鼠肝脏中提取IGFBP-1启动子，将单倍体GU压亚克隆成三倍体Gll比，重组构建成完整的胰岛素基因调控系统。后继试验将连接调控系统的胰岛素基因完整的装人逆转录病毒，感染肝细胞，以验证胰岛素的可调控性。为确保整个实验顺利进行，我们将IGFBP一1和Cll比基因片段，以及突变的人胰岛素原(饰INs)分别作限制酶图谱分析，并与逆转录病毒(pLxSN)相比较，选出可利用的酶切位点。本实验选取pUClls载体作为连接GLRE3、IGFBp一1克隆载体。叫Cll8载体的特点是多克隆位点较多，不仅能满足本实验的要求，还保证随后克隆MpINS仍有足够的酶切位点。我们获得了亚克隆到pUclls载体Sacl位点上的三倍体(Gll压)3，并在扩增IGFBP一1的PcR引物上设计了勒nl、Xbal两个酶切位点，以保证 PCR产物随后定向克隆到pUclls载体(Gll比)3下游。并利用重组体仍含有勒nl、Xbal酶切位点做酶切鉴定，利用pUclls载体上的引物通过 PCR方法鉴定重组体，最后将重组体送往大连宝生物测序鉴定，证明成功构建出含胰岛素抑制、葡萄糖激活调控系统的p
【学位单位】：中国医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2004
【中图分类】：R346

【参考文献】