B→O血型改造动物实验研究

发布时间：2020-09-27 08:09

　　 α-半乳糖苷酶(EC3.2.1.22)属外切糖苷酶类，在自然界中分布广泛，可在体外水解糖复合物。本课题组采用RT-PCR方法，从中国海南Catimor咖啡豆中克隆了α-半乳糖苷酶cDNA，全长1.1Kb，构建了其表达载体，电穿孔法导入毕赤酵母GS115细胞，筛选出重组α-半乳糖苷酶菌株。离子交换层析纯化出α-半乳糖苷酶，酶比活性从15U／mg提高到28.14U／mg。进一步鉴定了酶的生物化学性质，其Km=0.275mmol／L，Vmax=0.014mmol／L／min。本研究在此基础上，尝试了基因重组α-半乳糖苷酶菌株在5 L发酵罐中的表达扩增以及从发酵液中纯化α-半乳糖苷酶的研究。并在pH=5.5-5.6、每mL红细胞使用100U的基因重组α-半乳糖苷酶、26℃、2 h条件下，成功地清除了人B型红细胞表面B抗原。本研究着重开展了人B→O血型改造的动物实验研究，首先分别用吸收放散法和常规血型检测法筛选出合适的猕猴(rhesus monkey)和长臂猿(gibbon)，用批量制备的基因重组α-半乳糖苷酶对类人B型猕猴红细胞(rhesus monkey red blood cells，rRBC)和B型长臂猿红细胞(gibbon red blood cells，gRBC)表面抗原进行酶解，观察B抗原清除情况以及酶解对红细胞结构和功能是否有影响；经酶解后的B型红细胞再回输给类人A型猕猴和A型长臂猿，检测经α-半乳糖苷酶酶解后，供体红细胞在受体动物体内24h存活率和半衰期，观察其能否正常存活；对受血动物的输血安全性进行评价，分析回输后急性、慢性输血反应；以及检测受体动物体内有无因α-半乳糖苷酶引起的α-半乳糖苷酶抗体产生。实验证明：用100U／ml的α-半乳糖苷酶对类人B型猕猴和B型长臂猿的红细胞进行酶解，可以有效的清除猕猴红细胞类人B抗原和长臂猿红细胞B抗原；酶解后红细胞结构和功能未发生改变；回输给类人A型猕猴和A型长臂猿后，经α-半乳糖苷酶酶解的红细胞在受体动物体内24h存活率和半衰期与酶解前一致，符合FDA输血标准；受血动物尿液和血液生化指标未发生明显改变；受血动物体内无α-半乳糖苷酶抗体产生。总之，动物实验充分证明使用酶解反应后的通用O型血(Enzymatically 摘要 eonverted oroup 0 Red Blood eells，ECORBC)是安全的。动物实验的成功为今后申报B分O血型改造进入人体临床输血实验观察，奠定了重要基础。
【学位单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2003
【中图分类】：R392
【文章目录】：
缩略词表
摘要
Abstract
前言
第一部分基因重组α-半乳糖苷酶制备及B→O血型改变的研究
    1.1 、实验材料
    1.2 、实验方法
        1.2.1 、 α-半乳糖苷酶活性测定
        1.2.2 、发酵工艺流程
        1.2.3 、发酵液定性与定量分析
        1.2.4 、 α-半乳糖苷酶的纯化:
        1.2.5 、 α-半乳糖苷酶的鉴定
        1.2.6 、人B型红细胞的酶解改造
    1.3 、实验结果
        1.3.1 、 α-半乳糖苷酶的发酵
        1.3.2 、发酵液中α-半乳糖苷酶的纯化与鉴定
        1.3.3 、应用α-半乳糖苷酶进行人B→O血型改造
    1.4 讨论
第二部分 α-半乳糖苷酶酶解猕猴红细胞表面类人B抗原和长臂猿红细胞表面B抗原
    2.1 、实验材料
    2.2 、实验方法
        2.2.1 、猕猴实验部分
            2.2.1.1 、血样采集与血型的鉴定
            2.2.1.2 、 α-半乳糖苷酶酶解猕猴红细胞的类人B抗原
            2.2.1.3 、 α-半乳糖苷酶酶解猕猴红细胞类人B抗原的鉴定
            2.2.1.4 、 α-半乳糖苷酶酶解对猕猴红细胞结构功能的影响
            2.2.1.5 、酶解对猕猴红细胞在体内存活的影响
            2.2.1.6 、酶解后猕猴红细胞的输血实验
            2.2.1.7 、酶解红细胞回输后免疫反应的观察
        2.2.2 长臂猿实验部分
            2.2.2.1 、长臂猿血样采集与血型的鉴定
            2.2.2.2 、 α-半乳糖苷酶酶解长臂猿红细胞的B抗原
            2.2.2.3 、 α-半乳糖苷酶酶解长臂猿红细胞B抗原的鉴定
            2.2.2.4 、 α-半乳糖苷酶酶解对长臂猿红细胞结构功能的影响
            2.2.2.5 、酶解对长臂猿红细胞在体内存活的影响
            2.2.2.6 、酶解后长臂猿红细胞的输血实验
    2.3 、实验结果
        2.3.1 、猕猴实验部分
            2.3.1.1 、人抗-A、抗-B血清效价的测定结果
            2.3.1.2 、实验猕猴血型鉴定
            2.3.1.3 、酶解后猕猴血型的鉴定
            2.3.1.4 、酶解对猕猴红细胞结构和功能的影响
            2.3.1.5 、酶解红细胞在受血猕猴体内活存率
            2.3.1.6 、猕猴输血安全性评价
            2.3.1.7 、回输后α-半乳糖甘酶抗体检测结果
        2.3.2 、长臂猿实验部分
            2.3.2.1 、实验长臂猿血型鉴定
            2.3.2.2 、酶解后长臂猿血型的鉴定
            2.3.2.3 、酶解对长臂猿红细胞结构和功能的影响
            2.3.2.4 、酶解红细胞在受血猿体内活存率
            2.3.2.5 、输血安全性评价
    2.4 、讨论
总结
参考文献
致谢
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