三株含有人FGF-2、VEGF165-VEGF121基因非复制型腺病毒的构建和鉴定

发布时间：2020-10-09 17:56

　　 目的 构建三株含有hFGF2、hVEGF165、hVEGF121基因的非复制型重组腺病毒，以期用于皮瓣血运障碍的基因治疗。方法 以AdEasy系统为基础，利用原核细胞的同源重组机制构建非复制型重组腺病毒。首先设计引物，通过RT-PCR从Hep-2细胞(喉鳞癌细胞)的总mRNA中扩增得到三个目的基因的cDNA。分别将其重组到克隆载体pGEM-T Easy中，经测序证实后，进一步重组到穿梭质粒pShuttle-CMV上，获得分别含有三种不同目的基因的重组穿梭质粒。用Pme Ⅰ酶切线性化重组穿梭质粒，分别转化含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的E.coli BJ5183／p的感受态细胞，完成同源重组。取阳性克隆、小提质粒。再分别转化E.coliDHIOB感受态细胞，获得可产生高拷贝质粒的E.coli DH10B菌株。采用限制性内切酶分析、测序等方法对三种重组腺病毒质粒进行鉴定。最后将重组腺病毒质粒用Pac Ⅰ酶切，获得重组腺病毒DNA分子，用脂质体法，转染293包装细胞，得到三种重组腺病毒，并以PCR和RT-PCR法进行进一步鉴定。结果从Hep-2细胞中通过RT-PCR扩增得到hFGF2、hVEGF165、hVEGF121 cDNA并完成三种目的基因的重组克隆载体pT-hFGF2、pT-hVEGF165、pT-hVEG121和重组穿梭载体pShuttle-CMV-hFGF2，pShuttle-CMV-hVEGF165、pShuttle-CMV-hVEGF121的构建和鉴定；完成重组腺病毒质粒pAdE-hFGF2、pAdE-hVEGF165、pAdE-hVEGF121的构建及鉴定；获得三株分别含有相应目的基因的重组腺病毒AdE-hFGF2、AdE-hVEGF165、AdE-hVEGF121，PCR法证明三株重组腺病毒中，分别稳定地整合有hFGF2、hVEGF165、hVEGF121的基因，用RT-PCR方法分别检测了三株重组腺病毒感染细胞中的hFGF2、hVEGF165、hVEGF121特异性mRNA，结果表明这些基因可被有效地转录。结论 获得hFGF2、hVEGF165、hVEGF121三种基因的cDNA和三株含有hFGF2、hVEGF165、hVEGF121基因 安徽医科大学硕士学位论文 的重组腺病毒，并经鉴定，为皮瓣血运障碍的基因治疗研究奠定了基础。
【学位单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2004
【中图分类】：R346
【文章目录】：
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附录
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【共引文献】

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本文编号：2834003